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Se demuestra el uso de microarrays de ADN para la expresión de perfiles del sistema nervioso. Se describe el control de ARN de calidad, etiquetado de la muestra, y la hibridación de la matriz y de exploración.
Microarrays de perfiles de expresión del sistema nervioso proporciona un enfoque de gran alcance para la identificación de las actividades de genes en diferentes etapas de desarrollo, diferentes estados fisiológicos o patológicos, la respuesta al tratamiento, y, en general, cualquier condición que está siendo probado experimentalmente 1. Perfiles de expresión de los tejidos neurales requiere el aislamiento de ARN de alta calidad, la amplificación del ARN aislado y la hibridación de microarrays de ADN. En este artículo se describen los protocolos de los experimentos de microarrays reproducible a partir de tejido del tumor cerebral 2. Vamos a empezar realizando un análisis de control de calidad de aislados de muestras de ARN con 2100 de Agilent Bioanalyzer "lab-on-a-chip" de tecnología. De alta calidad las muestras de ARN son esenciales para el éxito de cualquier experimento de microarrays, y el Bioanalyzer 2100 proporciona una medición rápida y cuantitativa de la calidad de la muestra. Muestras de ARN se amplifican y etiquetados mediante la realización de la transcripción reversa para obtener ADNc, seguido por la transcripción in vitro en presencia de nucleótidos marcados para producir la etiqueta cRNA. Mediante el uso de un kit de marcaje de dos colores, que se etiqueta de la muestra experimental con Cy3 y una muestra de referencia con Cy5. Ambas muestras serán combinadas y se hibridan a las matrices K 4x44 de Agilent. Dos colores arrays ofrecen la ventaja de una comparación directa entre dos muestras de ARN, lo que aumenta la precisión de las mediciones, en particular para los pequeños cambios en los niveles de expresión, ya que las dos muestras de ARN se hibridan de manera competitiva a una sola micromatriz. Las matrices se analizarán en las dos longitudes de onda correspondientes, y la proporción de Cy3 a Cy5 señal para cada función se utiliza como una medida directa de la abundancia relativa del ARNm correspondiente. Este análisis identifica los genes que se expresan diferencialmente en respuesta a las condiciones experimentales se está probando.
1. Análisis de calidad de control de la muestra de ARN con 2100 Bioanalyzer
Antes de empezar,
2. Amplificación y etiquetado
Para prepararse para el análisis de microarrays, el RNA de muestras se amplifican y etiquetado, por lo general en una reacción basada en la RNA polimerasa T7 3. CDNA de doble cadena se genera por la transcripción reversa. cDNA se utiliza en una reacción de transcripción in vitro para generar lo que se conoce como cRNA. Esta reacción se lleva a cabo en presencia de ribonucleótidos etiquetado, la producción de cantidades de microgramos de ARN marcado para la hibridación de la matriz. La elección de los métodos de amplificación / etiquetado depende de la plataforma de microarrays después de ser utilizado. En esta sección, se describe la generación de la etiqueta fluorescente del ARN utilizando rápida Agilent kit etiquetado Amp.
3. Microarrays de hibridación
4. Microarrays de lavado
5. Los resultados representativos:
Buenas muestras de la calidad del ARN total debe producir sólo dos picos más importantes se ejecutan en un Bioanalyzer de control de calidad, correspondientes a las dos principales especies de ARN ribosomal. Algunos la degradación del ARN se verá como una prueba antes de que el primer pico de ARN ribosomal. Severamente degradados, el ARN de baja calidad se muestran un pico ancho y una serie de picos en los tiempos de retención baja, mientras que los dos picos de ARN ribosomal será de muy baja intensidad o no ser identificada en absoluto. Para ver ejemplos de la salida de 2100 Bioanalyzer, véase la figura 1.
El experto 2100 software calculará un número de la integridad del ARN, o RIN, como una medida cuantitativa de la calidad del ARN. Muestras de alta calidad, con valores de RIN superior a 9, son, evidentemente, mejor para las aplicaciones de microarrays. Sin embargo, se han utilizado muestras con valores de RIN tan bajo como 5,2 en la generación de datos de microarrays de calidad razonable.
Matrices de buena calidad debe producir una señal de alto en el PMT valores relativamente bajos. En nuestro experimento, la mayoría de las transcripciones se espera que estén presentes en niveles similares en la muestra experimental y de referencia; cambios masivos, muy extendida en la expresión de genes probablemente carecen de importancia biológica. Por lo tanto, la mayor parte de la matriz debe tener un color amarillento en vez de verde o rojo. Señales de buena calidad también debe estar en un rango dinámico de tal manera que los histogramas de señal totalmente superponen. Para ejemplos, véase la figura 2.
Figura 1. Ejemplo de cuatro muestras de ARN aislado de los tejidos humanos tumor cerebral. RNA fue aislado utilizando el protocolo presentado en el punto 3.1.1. Calidad de la muestra se evaluó utilizando el Bioanalyzer 2100 en un chip 6000 de ARN como se describe en el punto 3.1.3. Muestras sean representativas de cuatro distintas cualidades de ARN: una, muy buena la calidad del ARN (RIN> 9), B, parcialmente degradados ARN (RIN 5-6, tenga en cuenta el pico significativamente menor de 28S ARNr), C, muy degradados ARN (RIN < 3), D, casi totalmente degradadas ARN (RIN = 2). Hemos utilizado con éxito muestras con características similares o superiores a B (RIN> 5.2) para aplicaciones de microarrays de aguas abajo. Puntas de flecha sólida y abierta indicar la posición del 18S y 28S rRNA especies, respectivamente.
Figura 2. Ejemplos de imágenes de la matriz y los diagramas de dispersión. A ver, conjunto de diapositivas, que muestra las cuatro matrices en el formato 4X44K Agilent, B, escaneo de alta resolución de una de las áreas de la matriz, tenga en cuenta que ninguna de las señales (rojo o verde) es predominante; C, gráfico de dispersión de la imagen en B, tenga en cuenta que las señales se solapan por completo y no más de 1x10 -6 características se encuentran en la intensidad de saturación.
Perfiles de expresión con microarrays de ADN proporciona un método sencillo para identificar genes expresados diferencialmente entre las dos muestras biológicas. El éxito de los experimentos de perfiles de expresión requieren alta calidad de las muestras de ARN, el etiquetado y la hibridación robusta. En nuestra experiencia, las matrices comerciales y equipos de etiquetado de Agilent proporcionan datos de alta calidad a un costo razonable. Mientras Agilent también ofrece su hibridación y maquinaria de exploración, estamos a favor del sistema de hibridación de Roche-Nimblegen y el GenePix 4000B escáner de microarrays de Molecular Devices. Tenga en cuenta que la unidad de hibridación Roche-Nimblegen era conocido como el sistema de hibridación MAUI. Después de la reciente adquisición corporativa de Roche, los mezcladores A4 han sido descontinuados. A partir del momento de escribir esto, todavía se pueden encontrar a través de otros vendedores como los diagnósticos Kreatech ( www.kreatech.com ; este sitio web también ofrece una herramienta de amplia compatibilidad conveniente), pero a largo plazo la disponibilidad de stock es incierta. Otros sistemas de hibridación están disponibles (por ejemplo, de Agilent), sin embargo, si mezcladores compatibles se pueden encontrar por la matriz utilizada, se recomienda el sistema de la Roche-NimbleGen por su calidad y reproducibilidad.
Este trabajo fue apoyado por becas de ED de la Fundación James S. McDonnell 21 Programa de Premios del siglo XXI, y el Premio a la Innovación Nuevo Director del NIH. GAB fue apoyado en parte por una beca postdoctoral del Instituto de Medicina Regenerativa de California.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
A4 mixer hybridization chambers | |||
Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
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