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我々は、神経系の発現プロファイリングのためのDNAマイクロアレイの使用例を示します。我々は、RNAの品質管理、サンプルのラベリング、およびアレイハイブリダイゼーションとスキャニングを説明します。
神経系のマイクロアレイの発現プロファイリングは、開発のさまざまな段階で特定する遺伝子の活動への強力なアプローチ、さまざまな生理的または病理学的状態、治療への反応、及び、一般的に、実験的に1をテストされているいずれかの条件が用意されています。神経組織の発現プロファイリングは、単離されたRNAとDNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの増幅、高品質のRNAの分離を必要とします。この記事では、脳腫瘍の組織2からの再現性のあるマイクロアレイ実験のためのプロトコルについて説明します。我々は、Agilentの2100バイオアナライザ"ラボオンチップ"技術で分離されたRNAサンプルの品質管理分析を行うことにより開始されます。高品質なRNAサンプルは、任意のマイクロアレイ実験の成功のために重要である、と2100バイオアナライザは、サンプルの品質の迅速、定量的な測定を提供します。 RNAサンプルは、標識cRNAを生成するために標識されたヌクレオチドの存在下でin vitro転写により続いて、cDNAを得るために逆転写を行うことにより増幅し、ラベルが付いています。デュアルカラーラベリングキットを使用することにより、我々は、Cy3およびCy5と参照試料との我々の実験サンプルにラベルを付けます。両方のサンプルを、組み合わせるとAgilentの4x44 Kアレイにハイブリダイズされる。デュアルカラーの配列は、2つのRNAサンプルは、単一のマイクロアレイに競合ハイブリダイズされているため、それによって、発現レベルの小さな変化のために特に、測定の精度を高める、2つのRNAサンプル間の直接比較の利点を提供する。配列は2つの対応する波長でスキャンされ、そして各機能のCy3のにCy5シグナルの比率は、対応するmRNAの相対量の直接測定として使用されます。この分析では、差動テストされている実験条件に対応して発現される遺伝子を識別します。
1。 2100バイオアナライザによるRNAサンプルの品質管理分析
始める前に、
2。増幅とラベリング
マイクロアレイ解析の準備をするために、RNAサンプルは、T7 RNAポリメラーゼ3に基づく反応で、通常、増幅し、ラベルが付いています。二本鎖cDNAを逆転写によって生成されます。 cDNAは、cRNAをとして知られているものを生成するためのin vitro転写反応に使用されています。この反応は、アレイハイブリダイゼーションのためのラベルされたRNAのマイクログラム量を生産する、標識されたリボヌクレオチドの存在下で行われる。増幅/ラベリング方法の選択は、使用する後続のマイクロアレイプラットフォームに依存します。このセクションでは、Agilentのクイックアンプのラベリングキットを用いて蛍光標識したRNAの生成を説明します。
3。マイクロアレイハイブリダイゼーション
4。マイクロアレイの洗浄
5。代表的な結果:
品質管理のためにバイオアナライザで実行すると良い品質のトータルRNAサンプルは、2つの主要なリボソームRNA種に相当する、唯一の二つの主要なピークを生成する必要があります。いくつかのRNAの分解は、最初のリボソームRNAのピーク前にスメアとして表示されます。 2リボソームRNAのピークが非常に低い強度またはまったく識別がされる一方でパフォーマンスが著しく低下し、低品質のRNAは、低保持時間でブロードなピークまたはピークのシリーズが表示されます。 2100バイオアナライザの出力の例については、図1を参照してください。
エキスパート2100ソフトウェアは、RNAの品質の定量的な測定として、RNAの完全性の数、またはRINを計算します。高品質のサンプルは、9よりも高いRIN値で、マイクロアレイのアプリケーションに最適明らかです。しかし、我々は合理的な品質のマイクロアレイデータを生成するには5.2という低いRIN値でのサンプルを使用している。
良い品質の配列は、比較的低いPMT値で高信号を生成する必要があります。私たちの実験では、転写産物のほとんどは、実験とリファレンスサンプル中の同じようなレベルで存在することが期待され、遺伝子発現の大規模な、広範囲に変化はおそらく生物学的意義にも支障を来たしてしまう。したがって、配列のほとんどは黄色ではなく、緑色または赤色になるはずです。良好な品質の信号はまた、ダイナミックレンジで信号のヒストグラムが完全に重なるようなものであるべきである。例については、図2を参照してください。
図1人間の脳の腫瘍組織から分離されたfour RNAサンプルの例。 RNAは、3.1.1で紹介したプロトコルを用いて単離した。サンプルの品質は、3.1.3で説明されているRNAの6000チップで2100バイオアナライザを用いて評価した。サンプルは、4つの異なるRNAの質の代表的なものである:非常に良いRNAの品質(RIN> 9)、B、部分的に分解したRNA(RIN 5-6、28S rRNAのための有意に低いピークに注意)、C、高度に分解したRNA(RIN < 3)、D、ほぼ完全に分解したRNA(RIN = 2)。私たちは、下流のマイクロアレイアプリケーション用に類似またはB(RIN> 5.2)より良い品質でサンプルを正常に使用している。ソリッドとオープン矢印はそれぞれ、18Sおよび28S rRNAの種の位置を示している。
図2配列の画像と散布図の例。 4X44K Agilentの形式で4つの配列を示し、全体のスライドプレビュー、、B、配列の領域の一つの高解像度スキャンでは、信号のどちらも(赤または緑)が支配的であることに注意して、C、の画像の散布図B、 信号が完全に重なって、これ以上-6 × 10以上の機能が飽和強度にあることに注意してください。
DNAマイクロアレイによる発現プロファイリングは、2つの生物学的サンプル間の発現の異なる遺伝子を同定するための直接的なアプローチを提供します。成功した発現プロファイリング実験は、高品質なRNAサンプル、堅牢なラベリングとハイブリダイゼーションを必要とする。我々の経験では、Agilentから商業配列とラベリングキットは、妥当なコストで高品質なデータを提供しています。 Agilentはまた、独自のハイブリダイゼーションとスキャニング機構を提供する一方で、我々は、ロシュ、NimbleGen社と分子デバイスからGenePix 4000Bマイクロアレイスキャナーからハイブリダイゼーションシステムを好む。ロシュ- NimbleGen社のハイブリダイゼーションのユニットは、以前MAUIハイブリダイゼーションシステムとして知られていることに注意してください。ロシュによる最近の企業の買収後、A4のミキサーは廃止されました。これを書いている瞬間のように、彼らはまだそのようなKreatech診断(のような他の販売を通して見つけることができますwww.kreatech.com 、このウェブサイトはまた、便利な配列の互換性ツールを提供しています)が、長期在庫の有無は不明である。他のハイブリダイゼーションシステム(たとえば、アジレントから)使用できますが、配列が使用されて互換性のあるミキサーを見つけることができるなら、我々は、その品質と再現性のためにロシュ- NimbleGen社のシステムをお勧めします。
この作品は、ジェームズS.マクダネル財団21 世紀アワードプログラム、およびNIHのディレクターの新イノベーター賞からEDへの補助金によって支えられている。 GABは、再生医療のカリフォルニア工科大学からポスドクによって部分的にサポートされていました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
A4 mixer hybridization chambers | |||
Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
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