Method Article
Nós demonstramos o uso de microarrays de DNA para perfis de expressão do sistema nervoso. Descrevemos RNA controle de qualidade, rotulagem da amostra, e hibridização da matriz e de digitalização.
Microarray perfil de expressão do sistema nervoso fornece uma abordagem poderosa para a identificação de atividades gene em diferentes estágios de desenvolvimento, diferentes estados fisiológicos ou patológicos, resposta à terapia, e, em geral, qualquer condição que está sendo testada experimentalmente 1. Perfil de expressão de tecidos neurais exige isolamento de RNA de alta qualidade, a amplificação do RNA isolado e hibridização de microarranjos de DNA. Neste artigo vamos descrever protocolos de experimentos de microarray reprodutíveis a partir do tecido de tumor cerebral 2. Vamos começar por realizar uma análise de controle de qualidade das amostras de RNA isolado com 2100 da Agilent Bioanalyzer "lab-on-a-chip" de tecnologia. Amostras de RNA de alta qualidade são essenciais para o sucesso de qualquer experimento de microarray, e os Bioanalyzer 2100 fornece uma medida rápida e quantitativa da qualidade da amostra. Amostras de RNA são amplificados e rotulado através da realização de transcrição reversa para a obtenção de cDNA, seguido por transcrição in vitro na presença de nucleotídeos marcados para produzir cRNA rotulados. Usando um kit rotulagem dual-cores, vamos rotular nossa amostra experimental com Cy3 e uma amostra de referência com Cy5. Ambas as amostras serão então combinadas e hibridizado com arrays 4x44 da Agilent K. Duas cores matrizes oferecem a vantagem de uma comparação direta entre duas amostras de RNA, aumentando a precisão das medições, em especial para pequenas mudanças nos níveis de expressão, porque as duas amostras de RNA são cruzados competitivamente a um microarray único. As matrizes serão verificados nos dois comprimentos de onda correspondentes, ea proporção de Cy3 para Cy5 sinal para cada recurso será usado como uma medida direta da abundância relativa do mRNA correspondente. Esta análise identifica genes que são diferencialmente expressos em resposta às condições experimentais sendo testados.
1. Análise de controle de qualidade da amostra de RNA com 2100 Bioanalyzer
Antes de começar,
2. Amplificação e rotulagem
Para se preparar para análise microarray, amostras de RNA são amplificados e rotulado, geralmente em uma reação com base em T7 RNA polimerase 3. CDNA dupla fita é gerado pela transcrição reversa. cDNA é usada em uma reação de transcrição in vitro para gerar o que é conhecido como cRNA. Esta reação é realizada na presença de ribonucleotídeos rotulados, produzindo quantidades micrograma de RNA marcado para a hibridização matriz. A escolha de amplificação / rotulagem métodos depende da plataforma de microarray subseqüente a ser utilizado. Nesta seção, descrevemos a geração de RNA fluorescente etiquetado utilizando kit da Agilent rotulagem rápida Amp.
3. Hibridização de microarranjos
4. Lavar Microarray
5. Resultados representativos:
Boa qualidade total de amostras de RNA deve produzir apenas dois picos principais, quando executado em um Bioanalyzer para controle de qualidade, correspondente ao 2 principais espécies de RNA ribossômico. Alguma degradação RNA vai mostrar como uma mancha antes do pico RNA ribossomal primeiro. Severamente degradadas, RNA de baixa qualidade vai mostrar um pico amplo ou uma série de picos em tempos de retenção baixa, enquanto os dois picos ribossomal RNA será de intensidade muito baixa ou não identificáveis em tudo. Para exemplos da saída Bioanalyzer 2100, veja a figura 1.
O software 2100 de peritos irá calcular um número de integridade do RNA, ou RIN, como uma medida quantitativa da qualidade do RNA. Amostras de alta qualidade, com valores RIN superior a 9, são obviamente melhores para aplicações de microarray. No entanto, temos utilizado amostras com valores RIN tão baixo quanto 5,2 em geração de dados de microarray de qualidade razoável.
Matrizes de boa qualidade deve produzir sinal de alta em valores relativamente baixos PMT. Em nosso experimento, a maior parte das transcrições devem estar presentes em níveis semelhantes na amostra experimental e de referência; maciça, amplas mudanças na expressão genética provavelmente não têm qualquer significado biológico. Por isso, a maioria do array deve olhar amarelo, em vez de verde ou vermelho. Sinais de boa qualidade também deve estar em uma faixa dinâmica de tal forma que os histogramas sinal completamente sobrepõem. Por exemplo, veja a figura 2.
Figura 1. Exemplo de quatro amostras de RNA isoladas de tecido do cérebro humano tumor. RNA foi isolado utilizando o protocolo apresentado em 3.1.1. Qualidade da amostra foi avaliada através do Bioanalyzer 2100 em um chip 6000 RNA como descrito em 3.1.3. As amostras são representativas de quatro qualidades distintas RNA: A, muito boa qualidade RNA (RIN> 9); B, RNA parcialmente degradadas (RIN 5-6, observe o pico significativamente mais baixos para 28S rRNA); C, RNA altamente degradadas (RIN < 3); D, quase completamente degradadas RNA (RIN = 2). Temos utilizado com sucesso amostras com qualidades semelhantes ou melhores do que B (RIN> 5,2) para aplicações de microarray a jusante. Arrowheads sólida e aberta indicar a posição do 18S rRNA 28S e espécies, respectivamente.
Figura 2. Exemplos de imagens da matriz e gráficos de dispersão. A, visualização de slide todo, mostrando as quatro matrizes no formato Agilent 4X44K; B, varredura de alta resolução de uma das áreas de matriz, note que nenhum dos sinais (vermelho ou verde) é predominante; C, gráfico de dispersão da imagem em B, note que os sinais se sobrepõem totalmente e não mais de 1x10 -6 características são a intensidade de saturação.
Perfil de expressão com microarrays de DNA oferece uma abordagem simples para identificar genes diferencialmente expressos entre duas amostras biológicas. Experiências bem sucedidas de perfis de expressão exigir amostras de RNA de alta qualidade, etiquetagem robusta e hibridização. Em nossa experiência, as matrizes comerciais e kits de rotulagem Agilent fornecem dados de alta qualidade a um custo razoável. Enquanto Agilent também oferece sua própria hibridização e máquinas de varredura, nós somos a favor do sistema de hibridação de Roche-NimbleGen eo GenePix 4000B scanner microarray de dispositivos moleculares. Note que a unidade de hibridização Roche-NimbleGen era conhecido anteriormente como o sistema de hibridização MAUI. Após a recente aquisição empresarial pela Roche, o mixers A4 foram descontinuados. A partir do momento da redação deste texto, eles ainda podem ser encontrados através de outros vendedores, como Kreatech Diagnostics ( www.kreatech.com ; este site também oferece uma ferramenta conveniente compatibilidade array), mas a longo prazo disponibilidade de estoque é incerto. Sistemas de hibridação estão disponíveis (por exemplo, de Agilent), no entanto, se mixers compatíveis podem ser encontradas para a matriz a ser utilizado, recomendamos o sistema Roche-NimbleGen para a sua qualidade e reprodutibilidade.
Este trabalho foi financiado por doações de ED da S. James McDonnell Fundação 21 de Century Award Program, eo Prêmio Diretor do NIH Innovator Novo. GAB foi apoiado em parte por uma bolsa de pós-doutorado do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer |
2100 Bioanalyzer electrophoresis set | Agilent Technologies | G2947CA | |
RNA 6000 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips |
RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780M | |
Quick Amp labeling kit, two-color | Agilent Technologies | 5190-0444 | |
RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-542 | Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer |
Gene Expression Wash Buffer Kit | Agilent Technologies | 5188-5327 | Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102 |
Hybridization Station | Roche Group | 05223652001 | 4-slide model |
Hybridization System Accesory Kit | Roche Group | 05327695001 | Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer |
A4 mixer hybridization chambers | |||
Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray | Agilent Technologies | G4112F | |
Positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148504 | |
Capillary pistons for positive displacement pipette | Gilson, Inc. | F148415 | |
Microarray dryer | Nimblegen | 05223636001 | |
Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B | Molecular Devices | GENEPIX4000B | |
GenePix Pro 6.0 software | Molecular Devices |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados