Western Blot utilizando el Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Resumen

Este artículo técnico describe un estándar occidental-blot procedimiento que utiliza la electroforesis disponibles en el mercado NuPAGE Mini-Gel sistema de Invitrogen.

Resumen

Western Blot (o inmunotransferencia) es un procedimiento estándar de laboratorio que permite a los investigadores a comprobar la expresión de una proteína, determinar la cantidad relativa de las proteínas presentes en diferentes muestras y analizar los resultados de los experimentos de co-inmunoprecipitación. En este método, una proteína diana se detecta con un anticuerpo primario específico en una determinada muestra de tejido homogeneizado o extracto. Separación de proteínas en función del peso molecular se realiza mediante desnaturalización SDS-PAGE. Después de la transferencia a una membrana, la proteína de interés es determinada con un anticuerpo primario específico y detectado por quimioluminiscencia.

Desde su primera descripción, la técnica de western-blot ha sido objeto de varias mejoras, incluyendo pre-cast geles y equipos de fácil uso. En nuestro laboratorio, hemos optado por utilizar el sistema de electroforesis NuPAGE disponibles en el mercado de Invitrogen. Se trata de un pH neutro innovadoras, discontinuo SDS-PAGE, prefabricados de mini-gel del sistema. Este sistema presenta varias ventajas sobre la técnica tradicional de Laemmli, incluyendo: i) una vida útil más larga de los geles prefabricados que van desde 8 meses a 1 año, ii) un rango de separación amplia de pesos moleculares 1 a 400 kDa, dependiendo del tipo de de gel que se utiliza, y iii) una mayor versatilidad (rango de porcentaje de acrilamida, el tipo de gel, y la composición iónica del buffer de ejecución).

El procedimiento descrito en este artículo de vídeo utiliza el sistema Bis-Tris discontinua con 4-12% Bis-Tris gradiente de geles y MES funcionamiento de amortiguación, como una ilustración de cómo realizar un western blot, utilizando el sistema de electroforesis NuPAGE Invitrogen. En nuestro laboratorio, hemos obtenido buenos resultados y reproducible para diferentes aplicaciones bioquímicas utilizando este método occidental-Blot.

Protocolo

Electroforesis en gel

Nota técnica: Antes de comenzar el procedimiento, que las muestras de proteínas listo.

Durante este primer paso, las proteínas de la muestra se separan según su peso molecular mediante electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE). El NuPAGE ® tampón de muestra LDS cargado con dodecil sulfato de litio (LDS) mantiene polipéptidos en un estado desnaturalizado una vez que la muestra de proteína se ha calentado a 70 ° C durante 10 minutos. Un agente reductor fuerte se usa en conjunto para eliminar la estructura secundaria y terciaria (TDT, para romper los enlaces disulfuro). Además, las proteínas de la muestra que se cubra de la carga negativa LDS y por lo tanto se mueven a través de la malla de acrilamida del gel hacia el electrodo cargado positivamente. Esto permite su separación en función del peso molecular (medido en kilo Daltons, kDa).

Instrucciones detalladas paso a paso los protocolos para la preparación de la muestra y el procedimiento de la página se puede encontrar en la página web de Invitrogen ^2, o en la guía técnica NuPAGE ^3.

Consejos técnicos

1. En el sistema de Invitrogen NuPAGE Bis-Tris buffer discontinuo, la movilidad electroforética de las proteínas y el rango de la posterior separación del gel depende de dos factores: i) la concentración de acrilamida del gel (con mayor concentración de acrilamida que resulta en una mejor resolución de baja peso molecular proteínas) y ii) el ion de salida del buffer corriente, MOPS o MES. Para elegir la combinación adecuada para el rango de separación que se desea lograr, consulte la tabla de migración Gel ^1. El espesor del gel y el número de pozos dependerá del volumen y la cantidad de muestras que se va a cargar, respectivamente.
2. Al cargar las muestras en los pozos del gel, por lo menos un carril está reservado para un marcador de peso molecular (o escalera). Estas normas de proteínas se encuentran disponibles comercialmente a partir de varias compañías y por lo general consisten en una mezcla de proteínas teñidas de haber definido el peso molecular, con el fin de formar bandas visibles que le permiten seguir el progreso de la migración. Elija una distribución de pesos moleculares que es compatible con la resolución de gel.
3. Para lograr un patrón de migración amable y hasta le recomendamos que cargue todos los pozos de gel con un volumen similar de la muestra o 1X tampón de muestra LDS.

Transferencia

Nota técnica: Antes de comenzar la etapa de transferencia, preparar el tampón de transferencia (1X con metanol al 10%) y pre-enfriado a 4 ° C en una cámara frigorífica.

A fin de que las proteínas accesibles a la detección de anticuerpos, que son transferidos por electroblotting del gel a una membrana de nitrocelulosa. La unión a proteínas se basa en las interacciones hidrofóbicas, así como las interacciones de carga entre la membrana y las proteínas.

(Fluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana también se puede utilizar como una alternativa. En este caso, la membrana de PVDF se debe humedecer previamente en metanol al menos 30 segundos antes de su uso.)

Un detallado paso a paso el protocolo del procedimiento de transferencia se puede encontrar en la referencia 4 si se utiliza la Bio-Rad Mini Trans-Blot celular de transferencia electroforética, o en las referencias 2-3 si el laboratorio está equipado con la Invitrogen XCell II ™ Módulo Blot.

Como resultado de este proceso, las proteínas son expuestas en una delgada capa superficial y listo para su detección. La eficacia y la uniformidad global de transferencia de proteínas desde el gel a la membrana puede ser comprobado por la tinción de membrana tinte reversible Ponceau S.

Procedimiento de tinción Ponceau S (opcional):

1. Después de la transferencia de las proteínas, el lugar de la membrana en una bandeja de incubación (proteínas hacia arriba).
2. Añade suficiente tinción Ponceau S para cubrir la membrana e incubar por lo menos 30 segundos con una ligera agitación.
3. Enjuague la membrana con agua destilada hasta que el fondo es claro.
4. Destain la membrana con agua destilada durante 2-3 minutos.
5. Colocar la membrana en solución de bloqueo (ver más abajo).

Consejos técnicos:

1. Le recomendamos el etiquetado de sus membranas con un lápiz antes de la transferencia de proteínas con el fin de indicar el lado en el que las proteínas fueron expuestos y la orientación de las muestras.
2. Ambos Ponceau S manchas y los marcadores de peso molecular puede ser utilizado para cortar la membrana después de la transferencia para sondear las partes resultantes con diferentes anticuerpos

Inmunodetección:

Nota técnica: Este procedimiento inmunodetección se presenta como un modelo a seguir. Optimización puede ser necesario para cada hormigaibody, la información específica se puede encontrar en la mayoría de hojas de datos de los anticuerpos disponibles en el mercado (por ejemplo, la dilución de trabajo, tiempo de incubación, etc.)

Durante este último proceso, la proteína diana se detecta con un anticuerpo específico y aparecerá como una banda en la película. La posición de la banda depende del peso molecular de la proteína diana, mientras que la intensidad de la banda depende de la cantidad presente de la proteína diana.

Por lo general, esto se logra después de tres subetapas:

1. El bloqueo: para evitar interacciones no específicas del anticuerpo a la membrana (el exceso de espacio en la membrana está cubierta con una solución diluida de una proteína de genéricos).
2. Prueba: La proteína de interés se detecta por un determinado anticuerpo primario . Después de que el anticuerpo no ligado primaria se pierde, la membrana se expone a un anticuerpo diferente relacionado con el reportero de la enzima , la peroxidasa de rábano (HRP). Este anticuerpo secundario se dirige contra la parte de cada especie del anticuerpo primario (por ejemplo, un anticuerpo secundario anti-conejo se unen a cualquier conejo de origen anticuerpo primario).
3. Detección: Un agente quimioluminiscente es utilizado como un sustrato que se luminiscencia cuando se expone a la HRP en la secundaria de anticuerpos. Esta reacción produce luminiscencia en el lugar y en proporción a la cantidad de proteína investigado. La luz es detectada por una película fotográfica.

Un genérico paso a paso el procedimiento se proporciona a continuación. Otros procedimientos detallados se pueden encontrar en la ECL Plus Western Blot Detección manual de instrucciones Reactivos ⁵ o en la mayoría de la ficha técnica que acompaña los anticuerpos disponibles en el mercado. El tiempo de incubación, dilución de anticuerpos, y el bloqueo y las soluciones de lavado tiene que ser empíricamente optimizado para cada anticuerpo.

Inmunodetección procedimiento:

1. Bloquear la unión no específica de incubación con un volumen suficiente de solución de PBS caseína al 1% de bloqueo para cubrir toda la membrana. Colocar en un agitador durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
2. Incubar la membrana con el anticuerpo primario (específico para la proteína de interés). El anticuerpo primario debe ser diluido en solución de bloqueo. Para la mayoría de los anticuerpos, la unión completa se alcanza después de 1-2 horas de incubación a temperatura ambiente con agitación suave. Por otra parte, la etapa de incubación puede llevarse a cabo la noche a 4 ° C para aumentar la relación señal-ruido.
3. Eliminar la solución (descartar o mantener a 4 ° C y -20 ° C para uso repetido) y lave rápidamente la membrana de una sola vez. Luego 3X10 minutos con PBS, 0,05% de Tween 20 (PBST) a temperatura ambiente con agitación vigorosa.
4. Incubar la membrana con un anticuerpo HRP-junto secundario diluido en solución de bloqueo. Elija un anticuerpo que reconoce la parte de IgG de las especies que se planteó el anticuerpo primario. La incubación se realizó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.
5. Deseche la solución y lave rápidamente la membrana de una sola vez. Luego 3X10 minutos con PBST a temperatura ambiente con agitación vigorosa.
6. Proceder a la detección de quimioluminiscencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Usamos la ECL Plus Western Blot reactivos de detección de GE Healthcare (véase la referencia 5 para obtener instrucciones específicas).
7. Coloque la membrana en el abrigo de saran o una bolsa y colocar dentro de un casete de autorradiografía. Asegúrese de drenar el exceso de líquido y eliminar todas las burbujas de aire.
8. Exponer la película fotográfica a la membrana en un cuarto oscuro. Comience con un tiempo de exposición de 1 minuto y ajustar de acuerdo a la intensidad de la señal deseada.

Consejos técnicos:

1. El bloqueo de la unión no específica se logra mediante la colocación de la membrana en una solución diluida de proteína. Por lo general el uso del 1% de caseína, pero albúmina de suero bovino (~ 2% de BSA) o sin grasa de leche en polvo (~ 5%) puede ser utilizado como una alternativa.
2. Tris-Buffered Saline (TBS) se puede utilizar durante todo el procedimiento en lugar de PBS. Recomendamos el uso de TBS si va a probar su membrana con el anticuerpo phosphospecific.
3. El uso de un resplandor en la oscuridad etiqueta (por ejemplo, Glogos Stratagene ® II marcadores autorradiografía) tocó en la parte inferior de la cinta autorradiografía le ayudará a alinear su cine y su membrana durante la etapa de análisis.

Análisis

Ahora que ya ha expuesto su película, te darás cuenta que en la práctica, no todos los westerns revelar proteína en una sola banda buena. Additional bandas también pueden aparecer debido a la unión no específica de anticuerpos primaria y secundaria. Esta señal de fondo se puede reducir mediante la optimización del procedimiento de inmunodetección. Además, un control adecuado (por ejemplo, las células no transfectadas, las células tratadas con siRNA, etc) será útil para determinar la especificidad de sus anticuerpos y la ubicación exacta de la proteína diana en la membrana.

Después de marcar en la película de la posición de las bandas estándar de manchas de proteínas de la membrana, la trama en el registro de cada peso molecular de las normas de proteínas (eje y) en contra de su correspondiente movilidad relativa (eje X). Movilidad relativa (Rf) es el término utilizado para la relación de la distancia de la proteína se ha movido desde su punto de origen (parte superior del gel) en relación con la distancia que el tinte o el seguimiento de un marcador de bajo peso molecular se ha movido (el frente de gel) . Determinar la línea de regresión de la curva estándar para obtener los valores de pendiente y la intersección-. El peso molecular desconocido (tamaño) de la proteína de interés se calcula utilizando el Rf y la siguiente ecuación modificada:

registro de peso molecular = (pendiente) (Rf movilidad o de la proteína diana) + intersección

(Véase la referencia 6 para obtener instrucciones detalladas).

Aproximaciones nivel de expresión se toman mediante la comparación de la intensidad de la banda de la proteína diana a la de una proteína estructural (por ejemplo, la tubulina y actina) o un producto de limpieza de genes, como GAPDH. Este llamado "control de carga" no debería cambiar entre las muestras y se revela con un anticuerpo primario específico. La imagen puede ser más analizados por densitometría para evaluar la cantidad relativa de tinción de proteínas y cuantificar los resultados en términos de densidad óptica.

Discusión

El procedimiento que aquí se presenta utiliza un gel de Bis-Tris con MES funcionamiento de amortiguación como un ejemplo de la desnaturalización PAGE utilizando el sistema de electroforesis Invitrogen NuPAGE Novex. Además, este sistema de gel prefabricados permite la separación de proteínas en desnaturalización o no desnaturalización condiciones, así como se adapta a una amplia gama de pesos moleculares (1 a 200 kDa para los geles de Bis-Tris de 36 a 400 kDa para el Tris- geles de acetato). Dependiendo de su experiencia, usted pued...