Western Blot mit dem Invitrogen NuPage Novex Bis Tris Minigele

Zusammenfassung

Dieser technische Artikel beschreibt eine Standard-Western-Blot-Verfahren unter Verwendung der kommerziell erhältlichen NuPAGE Elektrophorese Mini-Gel-System von Invitrogen.

Zusammenfassung

Western Blot (oder Immunoblot) ist ein Standard Laborverfahren erlauben Ermittler auf die Expression eines Proteins zu überprüfen, Bestimmung der relativen Menge des Proteins in verschiedenen Proben und analysieren die Ergebnisse der Co-Immunopräzipitation Experimenten. In diesem Verfahren wird ein Zielprotein mit einem spezifischen primären Antikörper in einer Probe von Gewebehomogenat oder Extrakt nachgewiesen. Protein Trennung nach Molekulargewicht erfolgt über denaturierende SDS-PAGE. Nach dem Transfer auf eine Membran, wird das Zielprotein mit einem spezifischen primären Antikörper untersucht und nachgewiesen durch Chemilumineszenz.

Seit seiner ersten Beschreibung hat die Western-Blot-Technik eine Reihe von Verbesserungen, darunter Fertiggele und benutzerfreundliche Geräte unterzogen. In unserem Labor haben wir uns entschieden, das im Handel erhältliche NuPAGE Elektrophorese-System von Invitrogen verwendet. Es ist ein innovatives pH-neutral, diskontinuierliche SDS-PAGE, pre-cast Mini-Gel-System. Dieses System bietet mehrere Vorteile gegenüber dem traditionellen Laemmli-Technik einschließlich: i) eine längere Haltbarkeit der Fertiggele von 8 Monaten bis zu 1 Jahr; ii) eine breite Trennung Bereich von Molekulargewichten von 1 bis 400 kDa, abhängig von der Art Gel verwendet werden, und iii) eine größere Vielseitigkeit (Bereich von Acrylamid Prozentsatz, der Art des Gels, und die ionische Zusammensetzung der Laufpuffer).

Das Verfahren in diesem Video Artikel beschrieben nutzt die Bis-Tris diskontinuierlichen Puffersystem mit 4-12% Bis-Tris Gradientengele und MES-Laufpuffer, als Beispiel dafür, wie ein Western-Blot mit Hilfe der Unter Invitrogen NuPAGE Elektrophorese-System. In unserem Labor haben wir eine gute und reproduzierbare Ergebnisse für verschiedene biochemische Anwendungen mit diesem Western-Blot-Methode erhalten.

Protokoll

Gel-Elektrophorese

Technischer Hinweis: Vor dem Start des Verfahrens haben Sie Ihre Protein-Proben bereit.

Während dieses ersten Schritt werden die Proteine ​​in der Probe nach ihrem Molekulargewicht mit denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getrennt. Die NuPAGE ® LDS-Probenpuffer mit Lithium-Dodecylsulfat (LDS) geladen unterhält Polypeptiden in einem denaturierten Zustand, wenn die Protein-Probe wurde bei 70 ° C für 10 Minuten erhitzt worden. Ein starkes Reduktionsmittel in Verbindung verwendet werden, um sekundäre und tertiäre Struktur (DTT, um Disulfidbrücken Pause) zu entfernen. Darüber hinaus werden Probenproteinen in die negativ geladenen LDS abgedeckt und somit durch die Acrylamid Maschen des Gels bewegen sich zur positiv geladenen Elektrode. Dies ermöglicht die Trennung nach dem Molekulargewicht (gemessen in Kilo Dalton kDa).

Ausführliche Schritt-für-Schritt-Protokolle für die Probenvorbereitung und die PAGE Verfahren finden Sie auf der Website Invitrogen ² gefunden werden, oder in der NuPAGE technische Führung ^3.

Technische Tipps

1. In der Invitrogen NuPAGE Bis-Tris diskontinuierlichen Puffersystem ist die elektrophoretische Mobilität der Proteine ​​und die anschließende Trennung Bereich des Gels hängt von zwei Faktoren ab: i) die Acrylamid-Konzentration des Gels (mit mehr Acrylamid-Konzentration führt zu einer besseren Auflösung des unteren Molekulargewicht Proteine) und ii) der Hinterkante ion der Laufpuffer, MOPS oder MES. So wählen Sie die passende Kombination für die Trennung Bereich, den Sie erreichen wollen, um die Gel Migration Tabelle ¹ beziehen. Die Dicke des Gels und der Anzahl der Bohrungen werden auf das Volumen und die Anzahl der Proben, die Sie planen zu laden, bzw. ab.
2. Wenn Sie Ihre Proben Last in die Vertiefungen des Gels ist mindestens eine Fahrspur für ein Molekulargewichtsmarker (oder Leiter) vorbehalten. Diese Protein-Standards sind im Handel von mehreren Unternehmen zur Verfügung und in der Regel aus einer Mischung von gefärbten Proteine ​​mit definierten Molekulargewichten bestehen, so dass sichtbare Bänder, die Sie für die Migration Fortschritt folgen lassen zu bilden. Wählen Sie einen Bereich von Molekulargewichten, die mit Ihren Gel-Auflösung ist.
3. Um eine schöne und sogar Migrationsmuster empfehlen wir das Laden aller Bohrlöcher des Gels mit einem ähnlichen Volumen der Probe oder 1X LDS-Probenpuffer.

Transfer

Technische Anmerkung: Vor Beginn der Übertragung Schritt, bereiten Sie die Transfer-Puffer (1X mit 10% Methanol) und pre-cool bis 4 ° C in einem kalten Raum.

Um die Proteine ​​zugänglich Antikörpernachweis zu machen, werden sie durch Elektroblotting aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Proteinbindung ist auf hydrophobe Wechselwirkungen sowie Ladungs-Wechselwirkungen zwischen der Membran und Protein.

(Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran kann auch als Alternative verwendet werden. In diesem Fall muss die PVDF-Membran zu pre-Nass-in Methanol mindestens 30 Sekunden vor dem Gebrauch.)

Eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll der Übertragung Verfahren kann in Bezug 4 zu finden, wenn Sie die Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektrophoretische Übertragung Cell, oder in Verweisen 2-3, wenn Ihr Labor mit dem Invitrogen XCell II ausgestattet ist verwenden ™ Blot Module.

Als Ergebnis dieses Prozesses werden die Proteine ​​auf eine dünne Oberflächenschicht ausgesetzt und bereit für die Erkennung. Die Einheitlichkeit und die allgemeine Wirksamkeit der Übertragung von Protein aus dem Gel auf die Membran kann durch Farbstoff Membran der reversiblen Ponceau S-Färbung überprüft werden.

Ponceau S-Färbung Verfahren (optional):

1. Nach dem Übertragen der Proteine, legen Sie die Membran in einer Inkubationswanne (Proteine ​​nach oben).
2. Fügen Sie genug Ponceau S-Färbung der Membran abdecken und inkubieren Sie mindestens 30 Sekunden unter leichtem Schütteln.
3. Spülen Sie Membran mit destilliertem Wasser, bis der Hintergrund klar ist.
4. Entfärben der Membran mit fließendem destilliertem Wasser für 2-3 Minuten.
5. Legen Sie die Membran in Blocking-Lösung (siehe unten).

Technische Tipps:

1. Wir empfehlen Kennzeichnung Ihrer Membran mit einem Bleistift vor-Protein übertragen, um die Seite in dem die Proteine ​​wurden ausgesetzt und die Ausrichtung Ihrer Proben zu bezeichnen.
2. Beide Ponceau S-Färbung und der Molekulargewichtsmarker verwendet werden, um die Membran nach der Übertragung für die Erforschung der resultierenden Teile mit unterschiedlichen Antikörpern geschnitten werden

Immundetektion:

Technische Anmerkung: Diese Immundetektion Verfahren ist lediglich als Leitfaden zur Verfügung gestellt. Optimierung kann für jede Ameise erforderlichibody, spezifische Informationen finden Sie in den meisten Datenblättern der kommerziell erhältliche Antikörper (zB Gebrauchsverdünnung, Inkubationszeit, etc.) gefunden werden.

Während dieses letzten Prozesses wird das Zielprotein unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers und wird als Band auf dem Film erscheinen. Die Lage der Bande ist abhängig von dem Molekulargewicht des Zielproteins, während die Band Intensität hängt von der Menge an Ziel-Proteins vorhanden.

Normalerweise ist dies nach drei Teilschritten erreicht:

1. Blocking: Um unspezifische Wechselwirkungen der Antikörper mit der Membran (die überschüssige Speicherplatz auf der Membran wird mit einer verdünnten Lösung eines generischen Protein verdeckt) zu vermeiden.
2. Probing: Das Protein von Interesse ist durch eine spezifische erkannt Primärantikörper . Nach dem ungebundenen primären Antikörper weggewaschen wird, ist die Membran auf einem anderen Antikörper in Verbindung mit dem Reporter ausgesetzt Enzyms , Meerrettichperoxidase (HRP). Dieser sekundäre Antikörper ist gegen die Spezies-spezifische Teil des primären Antikörpers (z. B. eine Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper wird jedes Kaninchen-Source-Primär-Antikörper binden) gerichtet.
3. Detection: A Chemilumineszenz Agent wird als ein Substrat, das leuchten, wenn die HRP auf dem sekundären Antikörper ausgesetzt werden. Diese Reaktion erzeugt Lumineszenz in Ort und im Verhältnis zu der Menge an Protein untersucht. Das Licht wird dann von fotografischen Filmen erkannt.

Ein generisches Schritt-für-Schritt-Verfahren ist unten angegeben. Weitere detaillierte Verfahren kann in der ECL Plus Western Blotting Detektionsreagenzien Bedienungsanleitung ⁵ oder in den meisten Datenblatt Begleitung der kommerziell erhältliche Antikörper gefunden werden. Inkubationszeit, Antikörperverdünnung und Sperr-und Waschlösungen wurden empirisch für jedes Antikörpers optimiert werden.

Immundetektion Verfahren:

1. Blockieren Sie die unspezifische Bindung durch Inkubation mit genügend Volumen PBS 1% Casein blockiert Lösung für die gesamte Membran abzudecken. Legen Sie auf einer Wippe für mindestens 30 min bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
2. Inkubieren Sie die Membran mit dem primären Antikörper (spezifisch für das Protein von Interesse). Der primäre Antikörper sollten in Blocking-Lösung verdünnt werden. Für die meisten Antikörper, abgeschlossen ist verbindlich nach 1-2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln erreicht. Alternativ kann der Inkubationsschritt über Nacht bei 4 ° C durchgeführt werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
3. Entfernen Sie die Lösung (zu verwerfen oder zu halten bei 4 ° C bis -20 ° C für die wiederholte Verwendung) und schnell waschen der Membran wieder. Dann 3X10 Minuten mit PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) bei Raumtemperatur unter kräftigem Schütteln.
4. Inkubieren Sie die Membran mit einem HRP-gekoppelten sekundären Antikörper in Blockierungslösung verdünnt. Wählen Sie ein Antikörper, der IgG Teil der Arten, bei denen der primäre Antikörper wurde angehoben erkennt. Die Inkubationszeit ist für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln durchgeführt.
5. Entsorgen Sie die Lösung schnell und waschen Sie die Membran einmal. Dann 3X10 Minuten mit PBST bei Raumtemperatur unter kräftigem Schütteln.
6. Fahren Sie mit dem Chemilumineszenz-Detektion nach Angaben des Herstellers Belehrung. Wir nutzen die ECL Plus Western Blotting Detection-Reagenzien von GE Healthcare (siehe Referenz 5 für Anweisungen).
7. Zeigen Sie mit der Membran in Frischhaltefolie oder einem Beutel und im Inneren eine Autoradiographie-Kassette. Vergewissern Sie sich, um überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen und entfernen Sie alle Luftblasen.
8. Expose des fotografischen Films auf die Membran in einem dunklen Raum. Beginnen Sie mit einer 1 Minute Einwirkzeit und passen je nach gewünschter Signalintensität.

Technische Tipps:

1. Blockierung der unspezifischen Bindung wird erreicht, indem die Membran in einer verdünnten Lösung des Proteins erreicht. Wir verwenden in der Regel 1% Casein, aber Rinderserumalbumin (~ 2% BSA) oder fettfreie Trockenmilch (~ 5%) kann als Alternative verwendet werden.
2. Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) können während des gesamten Verfahrens anstelle von PBS verwendet werden. Wir empfehlen die Verwendung TBS, wenn Sie Ihre Membran mit phosphospezifische Antikörper-Sonde zu planen.
3. Die Verwendung eines glow-in-the-dark-Aufkleber (zB Stratagene Glogos ® II Autorad Marker) in der Unterseite der Autoradiographie Kassette abgehört wird Ihnen helfen, Ihr Film und Ihre Membran während der Analyse Schritt auszurichten.

Analyse

Jetzt haben Sie Ihren Film belichtet, werden Sie feststellen, dass in der Praxis nicht alle Westerns Proteins aufdecken als eine schöne Single-Band. Additional Bands kann auch auftreten, aufgrund der nicht-spezifische Bindung von primären und sekundären Antikörper. Dieser Hintergrund-Signal kann durch die Optimierung der Immundetektion Verfahren reduziert werden. Darüber hinaus wird eine entsprechende Steuerung (zB nicht transfizierten Zellen, siRNA-behandelten Zellen, etc.) nützlich sein, um die Spezifität der Antikörper und Ihr die genaue Lage des Zielproteins auf der Membran zu bestimmen.

Nach der Markierung auf dem Film die Position des gefärbten Proteins Standard-Bands aus der Membran, Grundstück das Protokoll von jedem Molekulargewicht der Protein-Standards (y-Achse) gegen die entsprechenden relativen Mobilität (x-Achse). Relative Mobilität (Rf) ist die Bezeichnung für das Verhältnis der Entfernung des Proteins aus seinem Ursprung (oben auf dem Gel) bezogen auf den Abstand der Tracking-Farbstoff oder ein niedermolekularer Marker bewegt hat eingesetzt bewegt hat (das Gel vorne) . Bestimmen Sie die Regressionsgerade der Standardkurve, um Werte für Steigung und y-Achse zu erhalten. Der unbekannte Molekulargewicht (Größe) des Zielproteins wird geschätzt, mit ihrer Rf und die folgende modifizierte Gleichung:

log Molekulargewicht = (Steigung) (Mobilität oder Rf des Zielproteins) + y-Achsenabschnitt

(Siehe Referenz 6 für detaillierte Anweisungen).

Expression Ebene Annäherungen sind durch den Vergleich der Bandenintensität des Zielproteins, dass ein strukturelles Protein (z. B. Tubulin oder Actin) oder ein Housekeeping-Gen-Produkt wie GAPDH genommen. Diese so genannte "loading control" sollte nicht zwischen den Proben zu ändern und offenbart mit einem spezifischen primären Antikörper. Das Bild kann durch Densitometrie der relativen Menge an Protein Färbung zu bewerten und zu quantifizieren, die Ergebnisse in Bezug auf die optische Dichte analysiert werden.

Diskussion

Das hier vorgestellte Verfahren verwendet eine Bis-Tris-Gel mit MES-Laufpuffer als ein Beispiel für denaturierende PAGE mit dem Invitrogen NuPAGE Novex Elektrophorese-System. Darüber hinaus ermöglicht diese pre-cast-Gel-System Protein Trennung unter denaturierenden oder nicht denaturierenden Bedingungen sowie Platz für eine breite Palette von Molekulargewichten (1 bis 200 kDa für das Bis-Tris Gele 36-400 kDa für das Tris- Acetat-Gele). Abhängig von Ihrem Experiment, können Sie festlegen, dass nur ein Teil der Western-Blotting hier b...