Western Blotting Usando o Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Resumo

Este artigo técnico descreve um procedimento de western-blotting usando o padrão disponível comercialmente NuPAGE sistema de eletroforese Mini-Gel da Invitrogen.

Resumo

Western Blot (ou immunoblotting) é um procedimento padrão de laboratório permitindo que pesquisadores para verificar a expressão de uma proteína, determinar a quantidade relativa das proteínas em diferentes amostras e analisar os resultados da co-imunoprecipitação experimentos. Neste método, uma proteína-alvo é detectado com um anticorpo específico primária em uma dada amostra de homogeneizado de tecido ou extrato. Separação de proteínas de acordo com o peso molecular é obtida através de desnaturação SDS-PAGE. Após a transferência para uma membrana, a proteína-alvo é sondado com um anticorpo primário específico e detectados por quimioluminescência.

Desde sua primeira descrição, a técnica de western-blotting passou por várias melhorias, incluindo a pré-cast géis e user-friendly equipamento. Em nosso laboratório, optou-se por utilizar o sistema de eletroforese comercialmente disponíveis NuPAGE da Invitrogen. É um pH neutro inovadoras, descontínua SDS-PAGE, pré-moldados sistema de mini-gel. Este sistema apresenta várias vantagens sobre a técnica de Laemmli tradicionais, incluindo: i) uma vida útil mais longa dos géis pré-moldados que variam de 8 meses a 1 ano; ii) uma ampla gama de separação pesos moleculares 1-400 kDa, dependendo do tipo de gel utilizados, e iii) maior versatilidade (variação de porcentagem de acrilamida, o tipo de gel, e da composição iônica do tampão de corrida).

O procedimento descrito neste artigo utiliza o vídeo Bis-Tris sistema tampão descontínuo com 4-12% Bis-Tris gradiente géis e MES tampão de corrida, como uma ilustração de como realizar um western blot usando o sistema de eletroforese Invitrogen NuPAGE. Em nosso laboratório, temos obtido bons resultados e reprodutível para várias aplicações bioquímicas usando este método western-blotting.

Protocolo

Eletroforese em gel

Nota técnica: Antes de iniciar o procedimento, têm as suas amostras de proteínas pronto.

Durante esta primeira etapa, as proteínas da amostra são separados de acordo com seu peso molecular por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (PAGE). O NuPAGE ® tampão de amostra LDS carregado com dodecilsulfato de lítio (LDS) mantém polipeptídeos em um estado desnaturado uma vez que a amostra de proteína foi aquecida a 70 ° C por 10 minutos. Um forte agente redutor é usado em conjunto para remover estrutura secundária e terciária (DTT, para quebrar pontes dissulfeto). Além disso, as proteínas da amostra se tornar abordados no LDS carga negativa e, portanto, mover-se através da malha de acrilamida do gel em direção ao eletrodo de carga positiva. Isto permite que a sua separação de acordo com o peso molecular (medido em kilo Daltons, kDa).

Detalhadas passo a passo protocolos para a preparação da amostra eo procedimento PAGE pode ser encontrado no site Invitrogen ^2, ou no NuPAGE técnicos guia ^3.

Dicas técnicas

1. No Bis-Tris Invitrogen descontínua NuPAGE sistema de buffer, a mobilidade eletroforética das proteínas ea faixa posterior separação do gel é dependente de dois fatores: i) a concentração do gel acrylamid (com maior concentração de acrilamida, resultando em uma melhor resolução de menor peso molecular de proteínas) e ii) o íon de fuga do tampão de corrida, MOPS ou MES. Para escolher a combinação apropriada para a faixa de separação que você deseja alcançar, referem-se à migração Gel ^um gráfico. A espessura do gel e número de poços dependerá do volume e da quantidade de amostras que você planeja para carregar, respectivamente.
2. Quando você carrega suas amostras nos poços do gel, pelo menos, uma pista é reservada para um marcador de peso molecular (ou escada). Estes padrões de proteínas estão comercialmente disponíveis a partir de várias empresas e tipicamente consistem de uma mistura de proteínas manchada ter definido pesos moleculares, de modo a formar bandas visíveis que permitem acompanhar o andamento da migração. Escolha uma gama de pesos moleculares que é compatível com a resolução do gel.
3. Para alcançar um padrão de migração legal e até recomendamos carregar todos os poços de seu gel com um volume similar de amostra ou tampão de amostra 1X LDS.

Transferência

Nota técnica: Antes de começar a etapa de transferência, prepare o buffer de transferência (1X com metanol 10%) e pré-arrefecer a 4 ° C em uma sala fria.

A fim de fazer as proteínas acessíveis a detecção de anticorpos, eles são transferidos pelo eletrobloting do gel para uma membrana de nitrocelulose. A ligação às proteínas é baseado em interações hidrofóbicas, bem como interações de carga entre a membrana e proteínas.

(Polivinilideno flúor membrana (PVDF) também pode ser usado como uma alternativa. Neste caso, a membrana PVDF precisa ser pré-molhada em metanol pelo menos 30 segundos antes do uso.)

Um protocolo de passo-a-passo detalhado do processo de transferência pode ser encontrada na referência 4, se você usar o Bio-Rad Mini Trans-Blot Celular transferência eletroforética, ou nas referências 2-3 se o seu laboratório está equipado com o XCell Invitrogen do II ™ Blot Módulo.

Como resultado deste processo, as proteínas são expostas em uma fina camada superficial e pronto para detecção. A eficácia e uniformidade global de transferência de proteínas do gel para a membrana pode ser verificado através da coloração do Ponceau S reversível da membrana corante.

Procedimento de Ponceau S coloração (opcional):

1. Depois de transferir as proteínas, coloque a membrana em uma bandeja de incubação (proteínas para cima).
2. Adicionar o suficiente de coloração Ponceau S para cobrir a membrana e incubar pelo menos 30 segundos com agitação suave.
3. Enxágüe membrana com água destilada até que o fundo é clara.
4. Destain a membrana com água corrente destilada por 2-3 minutos.
5. Colocar a membrana em solução de bloqueio (veja abaixo).

Dicas técnicas:

1. Recomendamos rotulagem sua membrana com um lápis antes da transferência de proteínas, a fim de denotar o lado em que as proteínas foram expostos ea orientação de suas amostras.
2. Ambos coloração Ponceau S e os marcadores de peso molecular pode ser usada para cortar a membrana após a transferência para sondar as partes resultantes com diferentes anticorpos

Imunodetecção:

Nota técnica: Este procedimento imunodetecção é fornecida como uma única diretriz. Otimização podem ser necessários para cada formigaiBODY; informações específicas podem ser encontrados na maioria das folhas de dados dos anticorpos comercialmente disponíveis (por exemplo, diluição de trabalho, tempo de incubação, etc.)

Durante este último processo, a proteína-alvo será detectado usando um anticorpo específico e aparecerá como uma banda no filme. A posição da banda é dependente do peso molecular da proteína-alvo, enquanto que a intensidade da banda depende da quantidade de proteína presente alvo.

Normalmente, isso é conseguido após três subetapas:

1. Bloqueio: Para evitar interacções não específicas do anticorpo com a membrana (o excesso de espaço na membrana é coberta com uma solução diluída de uma proteína genérico).
2. Sondagem: A proteína de interesse é detectada por um específico anticorpo primário . Depois que o anticorpo não ligado é lavado primário, a membrana é exposta a um anticorpo diferente ligada ao repórter enzima , peroxidase (HRP). Este anticorpo secundário é dirigido contra a porção espécie-específicos do anticorpo primário (por exemplo, um anticorpo anti-coelho secundário irá se ligar a qualquer anticorpo de coelho de origem primária).
3. Detecção: Um agente quimioluminescente é usado como um substrato que fluoresce quando exposto ao HRP no anticorpo secundário. Esta reação produz luminescência no lugar e na proporção da quantidade de proteína sondado. A luz é então detectada por um filme fotográfico.

Um procedimento passo-a-passo genérico é fornecido abaixo. Outros procedimentos detalhados podem ser encontrados no manual de Detecção Blotting ECL Plus ocidental instrução Reagentes ⁵ ou na maioria folha de dados que acompanham os anticorpos disponíveis comercialmente. Tempo de incubação, diluição do anticorpo, e bloqueio e soluções de lavagem tem de ser empiricamente optimizada para cada anticorpo.

Imunodetecção procedimento:

1. Bloqueiam a ligação não-específica pela incubação com volume suficiente de solução PBS caseína 1% para cobrir o bloqueio a membrana toda. Coloque em uma rocker por pelo menos 30 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
2. Incubar a membrana com o anticorpo primário (específico para a proteína de interesse). O anticorpo primário deve ser diluído em solução de bloqueio. Para a maioria dos anticorpos, a ligação completa é alcançada após 1-2 horas de incubação à temperatura ambiente sob agitação suave. Alternativamente, a etapa de incubação pode ser realizada durante a noite a 4 ° C para aumentar a relação sinal-ruído.
3. Remover a solução (descartar ou manter a 4 ° C e -20 ° C para utilização repetida) e rapidamente lavar a membrana uma vez. Então 3X10 minutos com PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) à temperatura ambiente com agitação vigorosa.
4. Incubar a membrana com um anticorpo HRP-coupled secundário diluído em solução de bloqueio. Escolha um anticorpo que reconhece a porção IgG da espécie, onde o anticorpo primário foi levantada. A incubação é realizada durante 1 hora a temperatura ambiente sob agitação suave.
5. Descartar a solução rápida e lavar a membrana uma vez. Então 3X10 minutos com PBST à temperatura ambiente com agitação vigorosa.
6. Proceder à detecção quimioluminescente de acordo com as instruções do fabricante. Usamos a ECL Plus ocidental reagentes de detecção Blotting da GE Healthcare (ver referência 5 para obter instruções específicas).
7. Coloque sua membrana em saran wrap ou uma bolsa e coloque dentro de um cassete de auto-radiografia. Certifique-se para drenar qualquer excesso de líquido e remova todas as bolhas de ar.
8. Expor o filme fotográfico à membrana em um quarto escuro. Comece com um tempo de exposição 1 minuto e ajustar de acordo com a intensidade do sinal desejado.

Dicas técnicas:

1. Bloqueio de ligação não específica é obtido pela colocação da membrana em uma solução diluída de proteínas. Normalmente usamos caseína 1%, mas albumina bovina (BSA ~ 2%) ou não-leite em pó desnatado (~ 5%) pode ser usado como uma alternativa.
2. Tris-Buffered Saline (TBS) pode ser usado durante todo o procedimento em vez de PBS. Recomendamos o uso de TBS se você pretende testar o seu membrana com o anticorpo phosphospecific.
3. O uso de um brilho-in-the-dark autocolante (eg, Glogos Stratagene ® da Marcadores II Autorad) bateu no fundo da gaveta autoradiografia vai ajudar você a alinhar seu filme e sua membrana durante a etapa de análise.

Análise

Agora que você tem exposto o seu filme, você vai perceber que em termos práticos, nem todos os Westerns revelam proteína como uma banda de solteira. Additional bandas também podem aparecer devido à ligação não específica de anticorpos primário e secundário. Este sinal de fundo podem ser reduzidos por meio da otimização do procedimento de imunodetecção. Além disso, um controle apropriado (por exemplo, as células untransfected, siRNA células tratadas, etc) será útil para determinar a especificidade do seu anticorpo ea localização exata da proteína alvo na membrana.

Após a marcação sobre o filme a posição das bandas de proteínas manchado padrão da membrana, plotar o log de cada peso molecular dos padrões de proteínas (eixo y) contra a sua mobilidade relativa correspondente (eixo-x). Mobilidade relativa (Rf) é o termo usado para a relação entre a distância a proteína passou de seu ponto de origem (parte superior do gel) em relação à distância a tintura de rastreamento ou um marcador de baixo peso molecular foi movido (a frente gel) . Determinar a linha de regressão da curva padrão para obter os valores de inclinação e intercepto y. O peso molecular desconhecido (tamanho) da sua proteína-alvo é estimado usando a sua Rf ea seguinte equação modificada:

registro do peso molecular = (inclinação) (Rf de mobilidade ou da proteína-alvo) + y-intercepta

(Ver referência 6 para instruções detalhadas).

Aproximações nível de expressão são tomadas por comparação da intensidade da banda da proteína-alvo para que de uma proteína estrutural (por exemplo, tubulina, ou actina) ou um produto de limpeza, tais como gene GAPDH. Este assim chamado "controle de carga" não deve mudar entre as amostras e é revelado através de um anticorpo específico primário. A imagem pode ser analisada por densitometria para avaliar a quantidade relativa de proteína coloração e quantificar os resultados em termos de densidade óptica.

Discussão

O procedimento sugerido aqui usa um gel Bis-Tris com MES tampão de corrida como um exemplo de desnaturação PAGE utilizando o sistema de eletroforese Invitrogen NuPAGE Novex. Além disso, este sistema de gel pré-cast permite a separação de proteínas sob desnaturação ou não desnaturante condições, bem como acomoda uma ampla gama de pesos moleculares (1-200 kDa para os géis Bis-Tris para 36-400 kDa para o Tris- géis de acetato). Dependendo da sua experiência, você pode optar por seguir apenas uma parte da técnica de western-bl...