西洋は、Invitrogen NuPage NOVEXビストリスミニゲルを用いたウェスタンブロット

要約

この技術記事では、Invitrogen社から市販されてNuPAGE電気ミニゲルシステムを使用して標準的なウェスタンブロッティング手順を説明します。

要約

西洋では（またはイムノ）ブロッティング捜査官は、タンパク質の発現を確認する、異なるサンプル中に存在するタンパク質の相対量を決定し、共免疫沈降実験の結果を分析できるように標準的な検査法です。この方法では、標的タンパク質は、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中の特定の一次抗体で検出される。分子量に応じてタンパク質の分離はSDS - PAGEを変性使用して実現されます。膜への転送後に、標的タンパク質は、特定の一次抗体でプローブされ、化学発光で検出。

その最初の記述以来、ウェスタンブロッティングの手法は、プリキャストゲルとユーザーフレンドリーな機器を含むいくつかの改良が施されています。当研究室では、我々はInvitrogen社から市販されてNuPAGE電気泳動システムを使用することにしました。それは革新的な中性pH、不連続SDS - PAGE、プレキャストミニゲルシステムです。 8ヶ月から1年までのプレキャストゲルの長い貯蔵寿命ⅰ）、ⅱ）1〜400 kDaの分子量の広い分離範囲はタイプによって定義：このシステムには含めて従来のLaemmliの手法に比べていくつかの利点を提示ゲル使用の;）とIII以上の汎用性（アクリルアミドの割合、ゲルの種類、および実行中の緩衝液のイオン組成の範囲）。

このビデオの記事で説明した手順4-12％ビス - トリス勾配ゲルとMESはインビトロジェンのNuPAGEの電気泳動システムを用いてウエスタンブロットを実行する方法の例として、バッファを実行するとビス - トリス不連続緩衝液系を利用しています。当研究室では、我々はこのウェスタンブロッティング法を用いて様々な生化学アプリケーション用の良いと再現性のある結果を得ている。

プロトコル

ゲル電気泳動

テクニカルノート ：手順を開始する前に、あなたのタンパク質サンプルをご用意。

この最初のステップで、サンプル中のタンパク質は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を用いてその分子量に従って分離されています。タンパク質サンプルを10分間70℃で加熱された後にドデシル硫酸リチウム（LDS）を搭載したNuPAGE ® LDSサンプルバッファーは、変性状態でポリペプチドを維持します。強力な還元剤は、二次および三次構造（DTT、ジスルフィド結合を破壊する）を削除するために組み合わせて使用​​されます。さらに、サンプルのタンパク質は負に帯電LDSで覆われてようになるため、正に帯電した電極に向かってゲルのアクリルアミドメッシュを介して移動する。これは、分子量（キロダルトン、kDaの単位で測定）にしたがってそれらの分離が可能になります。

試料調製とこのページの手順については、詳細なステップバイステップのプロトコルは、Invitrogen社のウェブサイト^2、またはNuPAGEテクニカルガイド³に見つけることができます。

技術上のヒント

1. インビトロジェンNuPAGEビス - トリス不連続緩衝液系では、タンパク質の電気泳動移動度とゲルのその後の分離の範囲は、次の2つの要因に依存しています：ⅰ）​​ゲルのacrylamid濃度（より低いのよりよい解決をもたらす大きなアクリルアミド濃度分子量蛋白質）及びii）を実行してバッファー、MOPSまたはMESの末尾のイオン。あなたが達成したい分離範囲の適切な組み合わせを選択するには、ゲルの移行図¹を参照してください。井戸のゲルと数の厚さは、ボリュームとは、それぞれ、ロードするサンプルの量に依存します。
2. あなたがゲルのウェルにあなたのサンプルをロードすると、少なくとも一つの車線は、分子量マーカー（またはラダー）用に予約されています。これらのタンパク質の基準は、移行の進行状況を追跡するための可視バンドを形成するように、いくつかの会社から市販されており、一般的に定義された分子量を有する染色されたタンパク質の混合物から構成される。あなたのゲルの解像度と互換性のある分子量の範囲を選択してください。
3. 素晴らしいとさえ移行パターンを達成するために我々は、サンプルまたは1X LDSサンプルバッファーの類似したボリュームを使用して、ゲルの全ウェルをロードすることをお勧めします。

転送

テクニカルノート ：転送ステップを開始する前に、トランスファーバッファー（10％メタノールと1X）と℃の低温室で4〜プレクールを準備。

抗体の検出にアクセス可能なタンパク質を作るためには、彼らはニトロセルロース膜にゲルからエレクトロブロッティングにより転送されます。タンパク質の結合は、疎水性相互作用だけでなく、膜とタンパク質の間の電荷の相互作用に基づいています。

（ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜は、代替として使用することができます。この場合には、PVDF膜は、メタノールで少なくとも30秒間使用前にプリウェットにする必要があります。）

ラボは、InvitrogenのX細胞IIが装備されている場合にはBio - Rad社製ミニトランスブロット電気泳動トランスファーセル、または参照2-3をご使用の場合、転送手順の詳細なステップバイステップのプロトコルは、参考文献4に記載されています™モジュールの汚点。

このプロセスの結果として、タンパク質は薄い表面層と検出のための準備で公開されています。ゲルからメンブレンへのタンパク質の移転の均一性と全体的な効果は可逆ポンソーS色素膜の染色により確認することができます。

ポンソーS染色の手順（オプション）：

1. タンパク質を転送した後、（タンパク質が上向きに）インキュベーショントレイに膜を置きます。
2. 膜をカバーし、穏やかに撹拌しながら、少なくとも30秒を培養するのに十分なポンソーS染色を追加。
3. 背景が透明になるまで蒸留水でメンブレンをリンス。
4. 2〜3分間蒸留水を実行していると膜を脱色する。
5. ブロッキング溶液で膜を置きます（下記参照）。

技術上のヒント：

1. 我々は蛋白質が露出された側とあなたのサンプルの向きを示すために、タンパク質の転送の前に鉛筆を使用して膜にラベルを付けることをお勧めします。
2. ポンソーS染色と分子量マーカーの両方が異なる抗体を用いて、結果の部分をプロービングするため、転送後の膜を切断するために使用することができる

免疫検出：

テクニカルノート ：この免疫検出の手順は、ガイドラインとしてのみ提供されています。最適化は、それぞれのアリのために必要となる場合がありますibody、具体的な情報は市販の抗体の大部分のデータシート（例えば、希釈、インキュベーション時間、等の作業）で見つけることができます。

この最後のプロセスの間に、標的タンパク質を特異的抗体を用いて検出され、フィルム上のバンドとして表示されます。バンドの強度が標的タンパク質の存在量に依存するのに対し、バンドの位置は、標的タンパク質の分子量の依存です。

通常、このは、次の3つのサブステップ後に達成される。

1. ブロッキング：メンブレン（膜上の余分なスペースは一般的な蛋白質の希薄溶液で覆われている）と抗体の非特異的相互作用を避けるために。
2. プロービング：目的のタンパク質が特定で検出された一次抗体 。未結合の一次抗体が洗い流さされた後、膜は、レポーターにリンクされている別の抗体にさらされている酵素 、 西洋ワサビペルオキシダーゼ （HRP）。この二次抗体を一次抗体の種特異的な部分（ 例えば抗ウサギ二次抗体は、任意のウサギ-情報源を一次抗体に結合される）に対して向けられている。
3. 検出：化学発光剤は、二次抗体にHRPにさらされた場合に冷光を発するれる基板として使用されます。この反応は、場所にし、プローブタンパク質の量に比例して発光を生成します。光は、写真フィルムで検出されます。

一般的なステップバイステップの手順を以下に用意されています。他の詳細な手順については、市販の抗体を伴うECL Plusはウェスタンブロッティング検出試薬の取扱説明書⁵にまたはほとんどのデータシートに記載されています。インキュベーション時間、抗体の希釈、およびブロッキングおよび洗浄溶液は、経験的にそれぞれの抗体のために最適化する必要があります。

免疫検出の手順：

1. 膜全体をカバーするためにPBS、1％カゼインブロッキング溶液の十分な量でインキュベートすることにより、非特異的結合をブロックする。室温で少なくとも30分間ロッカーの上に置いまたは4℃で一晩
2. あなたの一次抗体（目的のタンパク質に対して特異的）で膜をインキュベートする。一次抗体をブロッキング溶液で希釈してください。ほとんどの抗体は、完全な結合は、穏やかに攪拌下、室温で1-2時間のインキュベーション後に達成される。また、インキュベーションのステップは、信号対雑音比を高める° Cに4℃で一晩行うことができます。
3. 解決策を（° C -20 ° Cまで繰り返し使用するために破棄または4で保つ）を外し、すぐに一回膜を洗浄する。激しく振盪しながら室温でPBS、0.05％ツイーン20（PBST）でその後3X10分。
4. ブロッキング溶液で希釈したHRP結合二次抗体で膜をインキュベートする。一次抗体が提起された種のIgGの部分を認識する抗体を選択してください。インキュベーションは、穏やかに撹拌しながら室温で1時間行われます。
5. 液を捨て、すぐに一回膜を洗浄する。激しく振盪しながら室温でPBSTとし3X10分。
6. メーカーの指示にしたがって化学発光検出に進みます。我々は、GEヘルスケア（具体的な手順については参考文献5を参照）からECL Plusはウェスタンブロッティング検出試薬を使用。
7. サランラップやオートラジオグラフィーカセット内部のポーチと場所に膜を置きます。余分な液体を排出し、すべての気泡を除去することを確認してください。
8. 暗い部屋での膜への写真フィルムを公開。 1分間の露光時間で起動し、目的の信号強度に応じて調整する。

技術上のヒント：

1. 非特異的結合のブロッキングは、タンパク質の希釈溶液で膜を配置することによって達成されます。我々は、通常1％のカゼインを使用していますが、 ウシ血清アルブミン （〜2％BSA）または無脂肪ドライミルク（〜5％）を代替として使用することができます。
2. （TBS）トリス緩衝食塩水の代わりにPBSの手順全体で使用することができます。あなたがphosphospecific抗体を使用して膜をプローブすることを計画している場合我々はTBSを使用することをお勧めします。
3. の使用グローインザダークオートラジオグラフィーカセットの底部にタップステッカー（例えば、ストラタジーンのGlogos ® II Autoradマーカー）を使用すると、解析のステップ中に、フィルムや膜を整列するのに役立ちます。

分析

今、あなたのフィルムを露出していることは、実用的な面で、すべての西部劇一素敵な単一のバンドとしての蛋白質を明らかにしないことを認識するであろう。ピアツリーLバンドはまた、プライマリとセカンダリの両方の抗体の非特異的結合のために表示されることがあります。このバックグラウンドシグナルは免疫検出の手順を最適化することによって減らすことができます。さらに、適切な制御（例えば、トランスフェクトされていない細胞、siRNAを処理した細胞、など）は、抗体の特異性と細胞膜上の標的タンパク質の正確な位置を決定するために有用であろう。

フィルムに膜から染色されたタンパク質の標準バンドの位置をマーキングした後、それぞれの分子量のログをプロット それらに対応する相対移動度 （x軸）に対する蛋白質の基準（y軸）の。相対移動度（Rf）は、（ゲルの正面）に移動しているタンパク質は、距離のトラッキング色素または低分子量のマーカーからの相対原点のその点（ゲルの上部）から移動した距離の比率で使用される用語です。傾きとy切片の値を取得するための標準曲線の回帰直線を決定する。あなたの標的タンパク質の未知の分子量（サイズ）は、そのRfと、次の修正式を用いて推定される。

分子量=（傾き）（標的タンパク質の移動性またはRf）+ y切片を記録する

（詳しい手順については、基準6を参照）。

発現レベルの近似は、構造タンパク質（例えば、チューブリンやアクチン）あるいはGAPDHなどのハウスキーピング遺伝子産物のように標的タンパク質のバンド強度を比較することによって行われます。このいわゆる"ローディングコントロールは、"試料と特異的一次抗体を用いて明らかにされている間は変更しないでください。イメージがさらにタンパク質染色の相対量を評価し、光学密度の点で結果を定量化するデンシトメトリーにより分析することができる。

ディスカッション

ここに示す手順では、MESは、インビトロジェンNuPAGE NOVEXの電気泳動システムを使用してページを変性の例として、バッファを実行するとビス - トリスゲルを使用しています。さらに、このプレキャストゲルシステムは、変性または非変性条件下でタンパク質の分離を可能にするだけでなく、広範囲の分子量を（ビス - トリスゲルのための100から200 kDaのからのための36から400 kDaのトリス-対応アセテートゲル?...