A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.
המערבי סופג (או immunoblotting) הוא הליך סטנדרטי המאפשר לחוקרים מעבדה כדי לאמת את הביטוי של חלבון, לקבוע את כמות יחסית של ההווה חלבון בדגימות שונות, לנתח את התוצאות של שיתוף immunoprecipitation ניסויים. בשיטה זו, חלבון מטרה מזוהה עם נוגדן ראשוני ספציפי במדגם נתון homogenate רקמה או לחלץ. הפרדת חלבונים על פי משקל מולקולרי מושגת באמצעות denaturing SDS-PAGE. לאחר העברת קרום, חלבון המטרה היא חקרה עם נוגדן ראשוני ספציפי זוהה על ידי chemiluminescence.
מאז התיאור הראשון שלה, את הטכניקה המערבי סופג עבר מספר שיפורים, כולל מראש יצוק ג'ל ידידותי למשתמש הציוד. במעבדה שלנו, בחרנו להשתמש אלקטרופורזה זמינים מסחרית מערכת NuPAGE מן Invitrogen. זהו ה-pH נייטרלי חדשניים, רציפה SDS-PAGE, טרום יצוק מיני ג'ל המערכת. מערכת זו מציגה מספר יתרונות על פני השיטה המסורתית Laemmli כולל: א) חיי מדף ארוכים יותר של טרום יצוק ג'לים החל 8 חודשים עד שנה 1; ii) הפרדה מגוון רחב של משקלים מולקולריים 1-400 kDa בהתאם לסוג ג'ל המשמש וכן iii) רבגוניות גדולה יותר (בטווח של אחוז acrylamide, סוג של ג'ל, והרכב יוניים של למאגר ריצה).
ההליך המתואר במאמר זה וידאו מנצל את מערכת Bis-טריס חיץ רציפה עם 4-12% Bis-טריס צבע ג'ל MES ריצה חיץ, כמו איור של כיצד לבצע כתם המערבי באמצעות מערכת אלקטרופורזה Invitrogen NuPAGE. במעבדה שלנו, השגנו תוצאות טובות לשעתקו עבור יישומים ביוכימיים שונים בשיטה זו המערבי סופג.
ג'ל אלקטרופורזה
הערה טכנית: לפני שמתחילים את ההליך, יש דגימות חלבון שלך מוכן.
במהלך שלב זה הראשון, החלבונים במדגם מופרדים על פי משקל מולקולרי שלהם באמצעות denaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). ® NuPAGE הצפת LDS לדוגמה עמוסה סולפט Dodecyl ליתיום (LDS) שומרת פוליפפטידים במצב מפוגל פעם המדגם חלבון כבר מחוממת על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סוכן הפחתת חזקה משמש יחד כדי להסיר מבנה משניים ושלישוניים (DTT, לשבור אג"ח דיסולפיד). בנוסף, חלבונים מדגם להיות מכוסה LDS טעונים שלילית ולכן עוברים דרך הרשת acrylamide של הג'ל לכיוון האלקטרודה במטען חיובי. זה מאפשר הפרדה שלהם על פי משקל מולקולרי (נמדד קילו Daltons, KDA).
מפורט צעד אחר צעד פרוטוקולים להכנת הדגימה את ההליך PAGE ניתן למצוא באתר האינטרנט של Invitrogen 2, או הטכני NuPAGE מדריך 3.
טכנית טיפים
להעביר
הערה טכנית: לפני תחילת שלב העברה, להכין את החיץ ההעברה (1X עם מתנול 10%) מראש מגניב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר.
על מנת להפוך את החלבונים נגיש לאיתור נוגדנים, הם מועברים על ידי electroblotting מן הג'ל על גבי קרום nitrocellulose. מחייב חלבון מבוססת על אינטראקציות הידרופוביות, כמו גם יחסי הגומלין בין תשלום הממברנה וחלבונים.
(קרום polyvinylidene (PVDF) פלואוריד יכול לשמש גם כאלטרנטיבה. במקרה זה, את הממברנה PVDF צריך להיות מראש רטוב מתנול 30 שניות לפחות לפני השימוש.)
פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד של הליך העברת ניתן למצוא התייחסות 4 אם אתה משתמש Bio-Rad מיני חוצה כתם Cell העברת Electrophoretic, או הפניות 2-3 אם המעבדה שלך מצויד II XCell Invitrogen של ™ כתם Module.
כתוצאה מתהליך זה, חלבונים נחשפים על פני השטח בשכבה דקה מוכן לצורך זיהוי. האפקטיביות אחידות הכוללת של העברת חלבון מן הג'ל על הממברנה ניתן לבדוק על ידי מכתים קרום לצבוע Ponceau S הפיך.
מכתים הליך Ponceau S (אופציונלי):
טכנית טיפים:
Immunodetection:
הערה טכנית: הליך זה immunodetection מסופק כקו מנחה בלבד. אופטימיזציה עשויות להידרש כל נמלהibody; מידע ספציפי ניתן למצוא את רוב גליונות נתונים של נוגדנים זמינים מסחרית (לדוגמה, עובד דילול, זמן הדגירה, וכו ').
במהלך תהליך זה האחרון, היעד החלבון יזוהו באמצעות נוגדנים ספציפיים יופיעו כלהקה על הסרט. העמדה של הלהקה תלוי במשקל המולקולרי של חלבון המטרה, ואילו עוצמת הלהקה תלוי בכמות של ההווה חלבון המטרה.
בדרך כלל, זה הושג לאחר שלוש substeps:
הליך הגנרית צעד אחר צעד מוצג להלן. נהלים מפורטים נוספים ניתן למצוא במדריך ריאגנטים ECL פלוס המערבי סופג הוראה איתור 5 או ברוב גיליון הנתונים הנלווה נוגדנים זמינים מסחרית. זמן דגירה, דילול נוגדן, וחסימת ופתרונות לשטוף צריך להיות מותאם באופן אמפירי את כל הנוגדנים.
Immunodetection ההליך:
טכנית טיפים:
אנליזה
עכשיו שיש לך חשוף הסרט שלך, אתה תבין כי מבחינה מעשית, לא כל מערבונים לגלות חלבון כלהקה אחד נחמד. Additionaלהקות אני יכולה להופיע גם עקב מחייב הלא ספציפית של נוגדנים הן יסודי ותיכון. אות זה הרקע יכול להיות מופחת על ידי אופטימיזציה של תהליך immunodetection. בנוסף, פקד המתאים (למשל, תאים untransfected, siRNA שטופלו בתאים, וכו ') יהיה שימושי כדי לקבוע את הספציפיות של נוגדנים שלך את המיקום המדויק של חלבון המטרה על הממברנה.
לאחר סימון על הסרט את המיקום של תקן להקות מוכתמים בחלבון מן הקרום, העלילה יומן של כל משקל מולקולרי של תקני חלבון (ציר y) נגד ניידות יחסית המתאימים (ציר x). ניידות יחסית (RF) הוא מונח המשמש עבור יחס המרחק החלבון עבר מנקודת המוצא שלו (החלק העליון של הג'ל) ביחס למרחק לצבוע מעקב או סמן נמוך משקל מולקולרי עברה (הקדמי ג'ל) . קביעת קו רגרסיה של עקומת סטנדרט להשיג ערכים עבור השיפוע-y ליירט. משקל מולקולרי ידוע (גודל) של חלבון היעד שלך נאמד באמצעות Rf שלו שונה המשוואה הבאה:
יומן משקל מולקולרי = (שיפוע) (ניידות או Rf של חלבון המטרה) + Y-ליירט
(ראה התייחסות 6 לקבלת הוראות מפורטות).
רמת הביטוי קירובים נלקחים על ידי השוואת עוצמת הלהקה של חלבון היעד של חלבון מבנית (למשל, טובולין או אקטין) או גן משק המוצר כגון GAPDH. זה מה שנקרא "שליטה טוען" לא צריך לשנות בין דגימות מתגלה באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי. התמונה עשויה להיות מנותח על ידי צפיפות נוסף כדי להעריך את כמות יחסית של חלבון מכתים ולכמת את התוצאות במונחים של צפיפות אופטית.
הנוהל המובא כאן משתמשת ביס, טריס ג'ל עם MES ריצה חיץ כדוגמה denaturing הדף באמצעות NuPAGE Invitrogen מערכת Novex אלקטרופורזה. בנוסף, מערכת זו מראש יצוק הג'ל מאפשר הפרדה חלבון תחת denaturing או לא denaturing תנאים כמו גם להכיל מגוון רחב של משקלים מולקולריים (1-200 kDa עבור הג'לים Bis-טריס 36-400 kDa עבור טריס- Acetate...
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved