Вестерн-блоттинг Использование Invitrogen NuPage Novex бис Трис MiniGels

Резюме

Эта техническая статья описывает стандартные западных промокательной процедуры с использованием коммерчески доступных NuPAGE электрофореза Mini-гель системы от Invitrogen.

Аннотация

Вестерн-блоттинг (или иммуноблоттинга) является стандартной процедурой лаборатории позволяет исследователям проверить выражение белка, определяют относительное количество белков, присутствующих в различных образцов, а также анализировать результаты совместной иммунопреципитации экспериментов. В этом методе, белка-мишени обнаруживается с конкретными первичных антител в данном образце гомогената ткани или экстракта. Разделения белков по молекулярной массе достигается с помощью денатурирующих SDS-PAGE. После увольнения в мембране, белка-мишени будет тестироваться с конкретными первичного антитела и обнаружить хемилюминесценции.

С момента первого описания, западных промокательной техника претерпела ряд усовершенствований, в том числе сборных гели и удобным оборудованием. В нашей лаборатории мы решили использовать коммерчески доступные системы NuPAGE электрофорез с Invitrogen. Это инновационный нейтральный рН, разрывные SDS-PAGE, сборные мини-гелевой системы. Эта система представляет несколько преимуществ по сравнению с традиционной техникой Laemmli в том числе: я) дольше срок хранения сборных гели от 8 месяцев до 1 года; II) широкий спектр разделение молекулярным весом от 1 до 400 кДа в зависимости от типа геля используются; и в) большую универсальность (диапазон акриламида процентах, тип геля, и ионного состава работает буфера).

Процедуре, описанной в этой статье использует видео Bis-Tris разрывных буферной системы с 4-12% Bis-Tris градиент гели и МЧС работает буфер, в качестве иллюстрации того, как выполнять Вестерн-блот использованием электрофореза Invitrogen NuPAGE системы. В нашей лаборатории, мы получили хорошие и воспроизводимые результаты для различных биохимических приложений, использующих эту западных промокательной метод.

протокол

Гель-электрофорез

Техническое примечание: Перед началом процедуры, ваши образцы белка готов.

Во время этого первого шага, белков в образце разделяются в зависимости от их молекулярного веса использованием денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). NuPAGE ® LDS Пример буфер загружается с литий додецилсульфата (LDS) поддерживает полипептидов в денатурированного государства, раз белка образец был нагрет при 70 ° С в течение 10 минут. Сильный восстановитель используется совместно для удаления вторичной и третичной структуры (DTT, сломать дисульфидных связей). Кроме того, образцы белков покрываются в отрицательно заряженные LDS и, следовательно, двигаться через акриламида сетки геля к положительно заряженному электроду. Это позволяет их разделения в зависимости от молекулярной массы (измеряется в кило Дальтон, кДа).

Подробная шаг за шагом протоколов для подготовки проб и СТРАНИЦА процедуры можно найти на веб-сайте Invitrogen ^2, или в NuPAGE технического руководства ^3.

Технические советы

1. В Invitrogen NuPAGE Bis-Tris системы discontinous буфера, электрофоретической подвижности белков и последующее разделение диапазона геля зависит от двух факторов: я) acrylamid концентрации геля (с большей концентрацией акриламида в результате чего лучше разрешение ниже молекулярная масса белков) и б) заднего ионов работает буфер, MOPS или МЧС. Чтобы выбрать соответствующую комбинацию для разделения диапазона, который вы хотите добиться, см. диаграмму гель миграции ^1. Толщина геля и количество скважин будет зависеть от объема и количества проб, которые планируется нагрузки, соответственно.
2. Когда вы загружаете свои образцы в лунки геля, по крайней мере одна полоса предназначена для маркер молекулярного веса (или лестницы). Эти белковые стандарты имеются в продаже в нескольких компаниях, и обычно состоят из смеси окрашенных белков, определив молекулярного веса, так, чтобы образовать видимых полос, которые позволяют следить за миграцией прогресса. Выберите диапазон молекулярных масс, которая совместима с вашей гель разрешения.
3. Для достижения хорошей и даже миграция картины мы рекомендуем загрузки всех скважинах ваш гель с аналогичным объемом образца или 1X LDS образец буфера.

Передача

Техническое замечание: Перед началом передачи шаг, готовить передачи буфером (1х с 10% метанола) и предварительного охлаждения до 4 ° С в холодном помещении.

Для того, чтобы белки доступны для выявления антител, они передаются electroblotting из геля на нитроцеллюлозные мембраны. Связывание с белками основан на гидрофобных взаимодействий, а также заряд взаимодействие между мембраной и белка.

(Поливинилиденфторида (PVDF) мембрана может также использоваться в качестве альтернативы. В этом случае мембрана PVDF необходимо предварительно мокрые в метаноле в течение 30 секунд перед использованием.)

Подробное шаг за шагом протокол передачи процедуру можно найти в работе 4, если вы используете Bio-Rad Мини Trans-Blot Электрофоретическая сотовый перевод, или в 2-3 ссылки, если ваша лаборатория оснащена XCell II Invitrogen ™, Пятно модуля.

В результате этого процесса, белки подвергаются на тонком слое поверхности и готово к обнаружению. Единообразие и общая эффективность передачи белка из геля на мембрану можно проверить красителя окрашивание мембраны обратимым пунцовый S.

Окрашивание пунцовый S процедуры (по желанию):

1. После переноса белков, место мембраны в инкубационный лоток (белки вверх).
2. Добавьте достаточно Окрашивание пунцовый S для покрытия мембраны и инкубировать в течение 30 секунд с нежным агитации.
3. Промойте мембрану с дистиллированной водой до фоне ясно.
4. Destain мембраны с проточной дистиллированной воде в течение 2-3 минут.
5. Место мембраны в блокировании решения (см. ниже).

Технические советы:

1. Мы рекомендуем маркировка вашей мембраны с карандашом перед белка-переносчика для того, чтобы обозначить сторону, в которых белки были разоблачены и ориентацию образцов.
2. Оба окрашивания пунцовый S и маркеры молекулярного веса может быть использован, чтобы сократить мембраны после передачи для зондирования результате частей с различных антител

Иммунодетекции:

Техническое замечание: Это иммунодетекции процедура предусмотрена в качестве инструкции. Оптимизация может быть необходима для каждого муравьяibody; конкретную информацию можно найти в большинстве данных листов коммерчески доступных антитела (например, рабочие разведения, время инкубации и т.д.).

Во время этого последнего процесса, целевого белка будет обнаружить с помощью специфических антител и появится, как полосы на пленке. Положение полосы зависит от молекулярной массы белка-мишени, в то время как интенсивность полосы зависит от количества целевых настоящее белка.

Как правило, это достигается после трех подшагов:

1. Блокировка: Во избежание неспецифического взаимодействия антител с мембраной (лишнее пространство на мембране покрыта разбавленного раствора общий белок).
2. Зондирование: белок обнаруживается специфический первичного антитела . После несвязанных первичных антител вымывается, мембрана подвергается воздействию различных антител связан с репортером фермент , пероксидаза хрена (HRP). Это вторичное антитело направлено против видоспецифических часть первичных антител (например, анти-кролик вторичные антитела связываются с любого кролика-источников первичного антитела).
3. Обнаружение: хемилюминесцентного агента используется в качестве подложки, что будет светиться при воздействии на HRP на вторичные антитела. Эта реакция производит свечение в месте и в пропорции к количеству исследовали белок. Свет затем обнаружены фотопленки.

Общий шаг за шагом процедуры приводится ниже. Другие подробные процедуры можно найти в ECL Plus Вестерн-блоттинг Обнаружение Реагенты инструкции ⁵ или в большей части данных листов сопровождающих коммерчески доступных антител. Время инкубации, антитела разбавления, и блокирование и мыть эти решения должны быть эмпирически оптимизированы для каждого антитела.

Иммунодетекции процедуры:

1. Блок неспецифическое связывание путем инкубации с достаточным объемом PBS 1% казеина блокирующий раствор для покрытия всей мембране. Место на рокера, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
2. Инкубируйте мембраны с первичного антитела (специфические для белок). Первичного антитела должен быть разведен в блокировании решения. Для большинства антител, полного связывания достигается через 1-2 часа инкубации при комнатной температуре при легком волнении. Кроме того, инкубационный шаг может быть выполнен в течение ночи при 4 ° С до увеличения отношения сигнал-шум.
3. Удалить решение (отменить или сохранить при 4 ° С до -20 ° С для многократного использования) и быстро вымыть мембраны один раз. Затем 3х10 минут с PBS, 0,05% Твин 20 (PBST) при комнатной температуре при энергичном встряхивании.
4. Инкубируйте мембраны с HRP-связанной вторичными антителами разбавленный в блокировании решения. Выбрать антитело, которое распознает часть IgG из видов, где первичное антитело был поднят. Инкубационный осуществляется в течение 1 часа при комнатной температуре в легком помешивании.
5. Отменить решение и быстро вымыть мембраны один раз. Затем 3х10 минут с PBST при комнатной температуре, при энергичном встряхивании.
6. Приступить к хемилюминесцентный обнаружения в соответствии с инструкцией производителя. Мы используем ECL Plus Вестерн-блоттинг Обнаружение Реагенты от GE Healthcare (см. ссылку 5 для конкретных инструкций).
7. Наведите мембраны в Саран обертывание или мешочек и положите внутрь авторадиографии кассету. Убедитесь, что утечка любой лишней жидкости и удалить все пузырьки воздуха.
8. Expose фотопленки к мембранным в темной комнате. Начните с 1 минуты времени экспозиции и корректировать в зависимости от желаемой интенсивности сигнала.

Технические советы:

1. Блокирование неспецифическое связывание достигается путем размещения мембрану в разбавленный раствор белка. Обычно мы используем 1% казеина, но бычий сывороточный альбумин (~ 2% БСА) или обезжиренное сухое молоко (~ 5%) может быть использован в качестве альтернативы.
2. Трис-буферного раствора (TBS) может быть использован на протяжении всей процедуры, а не ФСБ. Мы рекомендуем использовать TBS, если вы планируете определить ваше мембраны с phosphospecific антител.
3. Использование светящихся в темноте наклейку (например, в Stratagene Glogos ® II Autorad маркеров) постучал в нижней части кассеты авторадиографии поможет вам выровнять ваш фильм и ваши мембраны в процессе анализа шаг.

Анализ

Теперь, когда вы выставили свой фильм, вы поймете, что с практической точки зрения, не все вестерны выявить белок, как один хороший одной зоны. Additionaл полосы могут также появиться из-за не-специфического связывания первичных и вторичных антител. На этом фоне сигнала может быть уменьшена за счет оптимизации иммунодетекции процедуры. Кроме того, надлежащий контроль (например, untransfected клеток, миРНК-обработанных клеток и т.д.) будут полезны для определения специфики Вашего антител и точное местоположение целевого белка на мембране.

После отметки на пленке положение окрашенных белков стандартных лент из мембраны, сюжет журнал каждого молекулярного веса белка стандартов (ось у) против их соответствующей относительной мобильности (оси Х). Относительная подвижность (R) является термином, используемым для отношение расстояния белка переехал с его точки происхождения (в верхней части геля) по сравнению с расстоянием отслеживания краситель или низким маркер молекулярного веса переехал (гель спереди) . Определение линии регрессии по стандартной кривой для получения значений для склона и у-перехват. Неизвестный молекулярный вес (размер) вашего целевого белка оценивается с использованием своего РФ и следующее модифицированное уравнение:

Журнал молекулярная масса = (наклон) (мобильность или РФ от целевого белка) + у-перехват

(См. ссылку 6 подробные инструкции).

Выражение приближения уровня принимаются путем сравнения интенсивности полосы из белка-мишени, что и структурных белков (например, тубулина или актина) или продукт гена домашнего хозяйства, таких как GAPDH. Это так называемая "нагрузка контроль" не должны меняться между образцами и раскрывается с помощью специального первичного антитела. Изображение может быть в дальнейшем проанализированы денситометрии для оценки относительного количества белка окрашивания и количественной оценки результатов в плане оптической плотности.

Обсуждение

Процедуры, представленные здесь использует Bis-Tris гель с МЧС работает буфер в качестве примера денатурирующих странице с помощью Invitrogen NuPAGE Novex электрофореза системы. Кроме того, эта сборных гель система позволяет разделения белков в денатурирующих или без денатурирующих условиях, а также вмещает ?...