Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

Özet

Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Özet

Western Blot (veya immün) araştırmacılar, bir proteinin ifade doğrulamak için izin veren bir standart laboratuvar prosedürü, farklı örnekleri protein mevcut bağıl miktarını belirlemek ve co-immunoprecipitation deneylerin sonuçlarını analiz. Bu yöntemde, bir hedef protein, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek belirli bir birincil antikor ile tespit edilir. SDS-PAGE denatüre kullanarak molekül ağırlığına göre protein ayırma sağlanır. Bir zar transferinden sonra, hedef protein belirli bir primer antikor ile probed ve kemilüminesans tarafından algılanır.

Western-blot tekniği ilk açıklamasını bu yana, prekast jeller ve kullanıcı dostu donanımları dahil olmak üzere çeşitli gelişmeler, uğramıştır. Laboratuvarımızda, Invitrogen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez sistemi kullanmayı tercih var. Bu yenilikçi bir nötr pH, süreksiz SDS-PAGE, prekast mini-jel sistem. 8 ay ile 1 yıl arasında değişen pre-cast jeller daha uzun bir raf ömrü i) ii) 1 ile 400 kDa molekül ağırlıkları geniş bir ayırma aralığı türüne bağlı olarak: Bu sistem de dahil olmak üzere, geleneksel Laemmli tekniği üzerinde birçok avantaj sunar jel kullanılır;) ve iii çok yönlülük (akrilamid yüzdesi, jel tipi ve çalışan tamponun iyonik bileşimi aralık).

Bu video makalede açıklanan prosedür Invitrogen NuPAGE elektroforez sistemi kullanarak bir western-blot gerçekleştirmek için nasıl bir örnek olarak,% 4-12 Bis-Tris degrade jeller ve MES tampon çalışan Bis-Tris süreksiz tampon sistemi kullanır. Laboratuvarımızda, biz bu batı-blot yöntemi kullanılarak çeşitli biyokimyasal uygulamalar için iyi ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmiştir.

Protokol

Jel elektroforezi

Teknik not: işlemine başlamadan önce, protein örneklerinin hazır olması.

Bu ilk adım sırasında, örnek proteinler denatüre poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanarak molekül ağırlığına göre ayrılır. Protein örneği, 10 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtılmış edildikten sonra Lityum Dodesil Sülfat (LDS) yüklü NuPAGE ® LDS örnek denatüre bir devlet arabellek polipeptidlerin korur . Güçlü indirgeyici ajan, ikincil ve üçüncül yapısı (DTT), disülfür bağları kırmak için kaldırmak için birlikte kullanılır. Buna ek olarak, örnek proteinleri negatif yüklü LDS kaplı hale gelir ve bu nedenle jel akrilamid örgü ile pozitif yüklü elektrot doğru hareket ettirin. Bu moleküler ağırlığı (kilo Dalton, kDa ölçülen) göre ayrılması sağlar.

Numune hazırlama ve PAGE işlemi için detaylı adım adım protokolleri Invitrogen web sitesi ² ya da NuPAGE teknik kılavuzu ³ olabilir

Teknik ipuçları

1. I) acrylamid jel konsantrasyonu (alt daha iyi çözünürlük ile sonuçlanan daha fazla akrilamid konsantrasyonu ile Invitrogen NuPAGE Bis-Tris süreksiz tampon sistemi, protein ve jel sonraki ayırma aralığı elektroforetik mobilite iki faktöre bağlıdır. molekül ağırlıklı proteinlerin) ve ii) çalışan tampon, MOPS veya MES sondaki iyon. Size ulaşmak istediğiniz ayırma aralığı için uygun kombinasyonu seçmek için, Jel Göç grafik ¹ bakın. , Kuyu jel sayısı ve kalınlığı, hacim ve miktar sırasıyla, yük planı örnekleri bağlıdır.
2. Kuyulara jel örnekleri yüklediğinizde, en az bir şerit bir moleküler ağırlık marker (veya merdiven) ayrılmıştır. Bu protein standartları Birçok şirket ticari olarak mevcuttur ve genellikle göç takip için izin görünür bantlar oluşturacak şekilde tanımlı molekül ağırlıkları olan lekeli proteinlerin karışımından oluşur. Molekül ağırlıkları jel çözünürlüğü ile uyumlu bir dizi seçin.
3. Güzel ve hatta göç desen elde etmek için benzer bir örnek veya 1X LDS örnek tampon hacmi ile jel TÜM kuyu yükleme öneririz.

Transfer

Teknik Not: transferi adım başlamadan önce, transfer tamponu (% 10 metanol ile 1X) ve soğuk bir odaya 4 ° C ön-cool hazırlar.

Proteinler antikor tespiti için erişilebilir hale getirmek için, onlar bir nitroselüloz membran üzerine jel electroblotting aktarılır. Protein bağlanma membran ve protein arasındaki hidrofobik etkileşimler, yanı sıra şarj etkileşimler üzerine kuruludur.

(Poliviniliden florid (PVDF) membran de alternatif olarak kullanılabilir. Bu durumda, PVDF membran, metanol içinde kullanmadan önce en az 30 saniye öncesi ıslak olması gerekir.)

Laboratuvar Invitrogen XCell II ile donatılmış olup olmadığını Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektroforetik Transferi Hücre, ya da referanslar 2-3 transfer prosedürü ayrıntılı bir adım-adım protokolü referans 4 bulunabilir ™ Modül Blot.

Bu sürecin bir sonucu olarak, proteinlerin ince bir yüzey tabakasının maruz kalan ve algılama için hazır. Protein jel membran transferi bütünlüğü ve genel etkinliği, geri dönüşümlü Ponceau G boya membran boyama ile kontrol edilebilir.

Ponceau G boyama işlemi (isteğe bağlı):

1. Proteinler aktardıktan sonra, bir kuluçka tepsi membran (proteinler yukarı bakacak şekilde) yerleştirin.
2. Membran kapak ve yavaşça sallanarak ile en az 30 saniye inkübe yeterli Ponceau G Boyama ekleyin.
3. Arka plan netleşene kadar, saf su ile membran durulayın.
4. 2-3 dakika distile su ile çalışan membran Destain.
5. Engelleme çözümü membran (aşağıya bakın) yerleştirin.

Teknik ipuçları:

1. Biz proteinler maruz edildiği örneklerin yan ve yönünü belirtmek için protein aktarmadan önce bir kalem ile membran etiketleme tavsiye ederiz.
2. Ponceau S boyama ve molekül ağırlığı belirteçleri Her iki farklı antikorları ile ortaya çıkan parçalar problama için transferinden sonra membran kesmek için kullanılan olabilir

İmmuno:

Teknik Not: Bu İmmuno işlem sadece bir kılavuz olarak verilmiştir. Optimizasyon her karınca için gerekli olabiliribody özel bilgiler piyasada bulunan antikorların çoğu veri-yaprak (örneğin, çalışma seyreltme, kuluçka süresi, vb.) bulunabilir.

Hedef protein bu son işlemi sırasında, belirli bir antikor kullanarak tespit edecek ve film bir grup olarak görünecektir. Grubun yoğunluğu hedef protein mevcut miktarına bağlıdır ise grubun konumu, hedef proteinin moleküler ağırlığı bağlıdır.

Tipik olarak, bu üç substeps sonra sağlanır:

1. Engelleme: membran (zarının üzerinde yer alan aşırı alan bir çözelti genel bir protein ile kaplıdır) ile non-spesifik antikor etkileşimleri önlemek için.
2. Problama ilgi protein belirli bir tarafından tespit birincil antikor . Ilişkisiz primer antikor yıkanıp sonra, membran muhabiri ile bağlantılı farklı bir antikor maruz enzim , horseradish peroksidaz (HRP). Bu ikincil primer antikor türlerinin belirli bir bölümünü (örneğin bir anti-tavşan ikincil antikor herhangi bir tavşan kaynaklı primer antikor bağlamak) karşı antikor yönlendirilir.
3. Algılama: Bir kemilüminesan ajan ikincil antikor HRP maruz kaldığında luminesce bir substrat olarak kullanılır. Bu reaksiyon ve probed protein miktarı ile orantılı olarak lüminesans üretir. Işık, daha sonra fotoğraf filmi tarafından tespit edilir.

Genel bir adım-adım prosedürü aşağıda verilmiştir. Diğer ayrıntılı yordamlar ECL Plus, Western Blot Tayin Reaktifleri kullanım kılavuzu ⁵ ya da data-sheet en piyasada bulunan antikorlar ile birlikte bulunabilir. İnkübasyon süresi, antikor seyreltme, ve engelleme ve yıkama çözümleri ampirik olarak her bir antikor için optimize olması.

İmmuno prosedürü:

1. Tüm membran kapak PBS% 1 kazein engelleme çözümü yeterli hacimde kuluçka tarafından non-spesifik bağlanma engelleyin. Oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle bir rocker yerleştirin ya da geceleme 4 ° C
2. Membran birincil antikor (faiz protein için özel) ile inkübe edin. Primer antikor çözümü engelleme seyreltilmelidir. En antikorlar için, tam bağlama yavaşça sallanarak altındaki oda sıcaklığında 1-2 saat inkübasyondan sonra elde edilir. Alternatif olarak, sinyal gürültü oranı artırmak ° C inkübasyon adımı 4 gece gerçekleştirilen olabilir.
3. Solüsyonu (4 ° C ile -20 ° C tekrar tekrar kullanım için atmayın veya tutmak) çıkarın ve membran hızlı bir kez yıkayın. Daha sonra PBS ile 3x10 dakika iyice sallanarak oda sıcaklığında% 0.05 Tween 20 (PBST).
4. Membran çözümü engelleme seyreltilmiş bir HRP-coupled ikincil antikor ile inkübe edin. Primer antikor büyüdü türlerin IgG kısmı tanıyan bir antikor seçin. Inkübasyon yavaşça sallanarak altında oda sıcaklığında 1 saat süreyle yapılır.
5. Çözüm atın ve membran hızlı bir kez yıkayın. Sonra iyice sallanarak oda sıcaklığında PBST ile 3x10 dakika.
6. Üreticinin talimatlarına göre kemilüminesan algılama geçin. Biz GE Healthcare (özel talimatlar için bkz: 5 referans) ECL Plus Western Blot Tayin Reaktifleri kullanın.
7. Saran wrap membran ya da bir otoradyografi kaset içine bir torba ve yer yerleştirin. Herhangi bir aşırı sıvı boşaltma ve tüm hava kabarcıkları kaldırmak için emin olun.
8. Karanlık bir odada membran fotoğraf filmi Açığa. 1 dakika maruz kalma süresi ile başlayın ve istenilen sinyal yoğunluğuna göre ayarlamak.

Teknik ipuçları:

1. , Non-spesifik bağlayıcı Engelleme bir protein çözelti membran koyarak elde edilir. Biz genellikle% 1 kazein, ancak sığır serum albumin (~% 2 BSA) bir alternatif olarak kullanılabilir veya yağsız kuru süt (~% 5).
2. Tris-Tamponlu Salin (TBS), PBS yerine işlem boyunca kullanılabilir. Phosphospecific antikor ile membran prob planlıyorsanız TBS kullanmanızı öneririz.
3. Glow-in-the-koyu, otoradyografi kaset alt dokundunuz etiket (örneğin, Stratagene Glogos ® II Autorad Belirteçler) analiz adımı sırasında film ve sizin membran hizalamak için yardımcı olacaktır.

Analiz

Filmin maruz Şimdi, pratik açıdan değil, Batılıların bir güzel tek bir grup olarak protein ortaya koyduğunu fark edeceksiniz. Additional bantları da non-spesifik primer ve sekonder antikor bağlanma nedeniyle görünebilir. Bu arka plan sinyali İmmuno prosedürünü optimize ederek azaltılabilir. Buna ek olarak, uygun bir kontrol (örneğin, untransfected hücreleri, siRNA-tedavili hücrelerde, vb.) Antikor özgüllüğü ve membran hedef protein tam yerini belirlemek için faydalı olacaktır.

Film membran lekeli standart protein bantları pozisyonu işaretlendikten sonra, her molekül ağırlığı günlük arsa bunlara karşılık gelen bağıl hareketlilik (x-ekseni) karşı protein standartları (y-ekseni). Bağıl hareketlilik (Rf) (jel ön) taşındı, protein uzaktan izleme boya veya düşük molekül ağırlıklı işaretleyici göre orijin noktası (jel üst) taşındı mesafe oranı için kullanılan bir terimdir . Regresyon hattının eğimi ve y kesişim noktası değerlerini elde etmek için standart eğri belirleyin. Hedef protein bilinmeyen molekül ağırlığı (boyut), Rf ve aşağıdaki denklemi kullanarak tahmin edilmektedir:

log molekül ağırlığı = (eğim) (hedef protein hareketlilik veya Rf) + y kesişim

(Ayrıntılı talimatlar için referans 6'ya bakınız).

İfade seviye yaklaşımları hedef proteinin yapısal bir protein (örneğin, tubulin veya aktin) ya da bu tür GAPDH gibi bir housekeeping gen ürünü bu grubun yoğunluğunu karşılaştırarak alınır. Bu sözde "yükleme kontrolü" örnekleri arasında değişmez ve belirli bir birincil antikor ile ortaya çıkar. Görüntü daha da göreli miktarda protein boyama, optik yoğunluk açısından sonuçları değerlendirmek ve ölçmek için dansitometrisi tarafından analiz edilebilir.

Tartışmalar

Burada sunulan prosedür MES denatüre SAYFA Invitrogen NuPAGE Novex elektroforez sistemi kullanarak bir örnek olarak tampon çalışan bir Bis-Tris jel kullanıyor. Buna ek olarak, bu prekast jel sistemi denatüre veya non-denatüre koşullarının yanı sıra altında protein ayrılmasına izin molekül ağırlıkları geniş bir yelpazede (1-200 kDa Bis-Tris jeller için 36-400 kDa Tris-uygun Asetat jeller). Denemenizi bağlı olarak, burada açıklanan batı blot tekniği sadece bir bölümünü doğrudan jel boyama işlemleri (örneğ...