El trasplante de células del estroma mamario y células de carcinoma en los ratones C57BL/6J

Resumen

En este informe, demuestran un sistema para aislar y cultivar células de donantes de la glándula mamaria de ratón, y ortotópicamente trasplante de estas células en ratones receptores para analizar estroma: interacciones epiteliales durante el desarrollo de tumores mamarios.

Resumen

La influencia de las células del estroma, incluyendo los fibroblastos en la progresión del tumor de mama ha sido bien documentada a través de la utilización de modelos de ratón, en particular a través del trasplante de células del estroma y las células epiteliales en la glándula mamaria de ratones. Los modelos actuales del trasplante a menudo incluyen el uso de ratones inmunodeficientes, debido a los diferentes orígenes genéticos de las células del estroma y células epiteliales. Matrices extracelulares se utilizan a menudo para integrar los dos tipos diferentes de células de consistente interacciones célula-célula, sino que implican el uso de Matrigel o colágeno cola de rata, que son sustratos inmunogénica. La falta de funcionamiento las células T de ratones inmunodeficientes impide una evaluación precisa de las células del estroma en la progresión del tumor mamario en vivo, con importantes implicaciones en el desarrollo de fármacos y su eficacia. Por otra parte, los ratones inmunodeprimidos son costosos, difíciles de reproducir y requiere condiciones especiales de atención. Para superar estos obstáculos, hemos desarrollado un método para el trasplante de células del estroma ortotópicamente y las células epiteliales en ratones a partir de los mismos antecedentes genéticos para inducir la formación de tumores consistente. Este sistema consiste en la recolección normal, carcinoma de los fibroblastos asociados, PyVmT células de carcinoma de mama y el colágeno de donantes ratones C57BL/6J. Las células son entonces integrados en el colágeno y trasplantados en las glándulas mamarias de las mujeres inguinal ratones C57BL/6J. El trasplante de células PyVmT hablar de formar tumores palpables 30-40 días después del trasplante. Análisis de seguridad de 60 días indica que la co-trasplante con los fibroblastos aumenta el crecimiento del tumor de mama en comparación con las células trasplantadas PyVmT solo. Mientras que las células y la matriz de ratones C57BL/6J fueron utilizados en estos estudios, el aislamiento de células y la matriz y el enfoque del trasplante puede ser aplicado a ratones de diferentes bases genéticas que demuestran la versatilidad. En resumen, este sistema puede ser usado para investigar las interacciones moleculares entre las células del estroma y las células epiteliales, y supera las limitaciones críticas en modelos de ratones inmunodeficientes.

Protocolo

1. El aislamiento y la extracción de colágeno de donantes de ratones C57BL/6J

1. Sacrificio de los ratones normales madura mujer C57BL/6J utilizando métodos aprobados IACUC.
2. Cosecha de las colas y de inmersión en etanol al 70% durante 45 minutos para esterilizar tejidos. Seca la cola con papel de seda, envuelva en papel aluminio. Tienda de las colas de -20 ° C hasta que se necesite.
3. Coloque la cola en un ambiente estéril, como una campana de flujo laminar. Con la tijera, dividir la piel en la base de la cola y se desprenden de la cola. Quitar 0,5 a 1 cm de ambos extremos de la cola y se divide la cola restante en tres o cuatro piezas. Diseccionar los tendones de las colas y separar los tendones en fibras individuales utilizando una hoja de bisturí o navaja.
4. Transferencia de las fibras del tendón de un recipiente estéril y lavar con agua destilada estéril. Los tendones de transferencia de la cola de ratones 5-7 a un tubo cónico de 50 ml que contiene 35 ml de agua estéril desionizada agua que contiene 50 unidades / ml de penicilina penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina y 250 ng / ml de anfotericina, y 0,034 N de ácido acético diluido una solución madre de ácido acético glacial (17 N). Lugar el rockero a 4 ° C durante una semana para extraer el colágeno.
5. Centrifugar los residuos en una centrífuga de mesa en 3000 g durante 15 minutos. Transferir el sobrenadante, aproximadamente 30 ml en dos tubos de policarbonato está adaptado para Beckman 50.2 Ti rotor y giran a 35.000 g (aproximadamente 17.000 rpm) durante 1 hora.
6. El volumen del sobrenadante tendrá que ser reducido para lograr una concentración de 1-2 mg / ml. Transferir el sobrenadante a una unidad de filtración Ultracel 50 k Amicon y girar en una centrífuga de mesa a 3000 rpm por 15 a 4 ° C. Transferir el filtrado a un tubo cónico estéril y guardar. Repetir la centrifugación hasta que el volumen se reduce a 6.5 ml.
7. Lea la concentración de proteínas. Nosotros usamos un estándar ensayo de Bradford (BioRad), utilizando BSA normas (BioRad) y las muestras sin diluir. Medir una muestra de su filtrado, como control negativo.
8. Posteriormente la pureza de la extracción mediante la resolución de una muestra de colágeno purificado en un gel de poliacrilamida al 6% SDS, 10 carriles, de 1,5 mm de espesor de gel. Prepare 20 mg de la muestra en 30 l de tampón de carga 1x SDS-PAGE que contiene 63 mM Tris HCl 10% de glicerol, 2% SDS 0,0025% de azul de bromofenol en 1,5 ml tubos Eppendorf. Prepare una cantidad equivalente de proteína de colágeno tipo I cola de rata como control positivo. Además, preparará un conjunto de normas de BSA en el 2,5, 5, 10, 20 mg diluidos en PBS 1X y el tampón de carga. Hervir las muestras a 95 ° C durante 5 minutos.
9. Deje que las muestras frescas y microfuga brevemente (la velocidad máxima durante 10 segundos) para hacer girar hacia abajo la condensación.
10. Cargar las muestras muestras junto con un marcador de peso molecular. Por ejemplo, carga de 5 l de estándar de la proteína Biorad Kaleidoscope. Electroforesis a 150 voltios durante aproximadamente 1 hora o hasta que el frente tinte llega al fondo.
11. Quitar el gel y tinción con Coomassie en buffer azul. Prepare el buffer mediante la mezcla de 2 g de azul de Coomassie, 75 ml de ácido acético glacial, 500 ml de etanol en un volumen total de 1000 ml que contiene agua desionizada. También hay que preparar la misma cantidad de tampón destain usando la receta, excepto sin reactivo Coomassie azul. Cubrir el gel con un volumen suficiente de azul de Coomassie y el lugar en una mecedora.
12. Roca lento durante 1 hora a temperatura ambiente y decantar la mancha. Sustituir la solución destain cuando se vuelve azul oscuro. Detener el gel durante la noche o hasta que las bandas individuales se resuelven en el gel. Busque dos bandas de colágeno (peso molecular = 90 kDa y 130) y tenga en cuenta la fuerza de las bandas en contra de las normas y los controles. Imagen del gel usando un sistema de gel doc, si es necesario.

2. Aislamiento y cultivo de las células del donante carcinoma de mama y fibroblastos de ratones C57BL/6J normales y PyVmT

1. Edad sacrificio emparejado mujeres ratones transgénicos normal o PyVmT después de 10 semanas de edad cuando los tumores son evidentes y palpables en PyVmT ratones transgénicos utilizando métodos aprobados IACUC.
2. Exponer el ratón sobre la espalda en una superficie plana e inmovilizar las extremidades con cinta adhesiva.
3. Hacer una incisión en T invertida entre los pezones de la glándula mamaria torácica e inguinales y tirar de la solapa de piel para exponer las glándulas mamarias. Eliminar los tejidos mamarios y picar en trozos pequeños con unas tijeras quirúrgicas.
4. Preparar 100 ml de un cóctel de digestión enzimática que contiene: 200 mg de tripsina, 500 mg de colagenasa, 4 mg DNAsa, 100.000 unidades de hialuronidasa en PBS estéril y antibióticos durante la noche en hielo y luego de 3 horas a 37 ° C.
5. Añadir 10 ml de PBS con 10% de suero fetal bovino (SFB) a cada muestra y centrifugar el sedimento celular en una centrífuga de mesa a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 ° C.
6. Aspire con cuidado el sobrenadante y resuspender el botón celular en 5-7 ml de FBS% PBS/10. Repita el giro y lavar dos veces más.
7. Resuspender el botón celular en 10 ml de DMEM con 10% FBS contiene 50 unidades / ml de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina y 250 ng / ml de anfotericina en platos de 10 cm recubiertas con colágeno tipo I. Para las placas con capa de colágeno, el colágeno diluir 1 ml (con valores de 1,5 mg / ml) en 39 ml de 0,02 N de ácido acético diluido en agua destilada estéril o PBS. Pipetear 5 ml de solución de colágeno de trabajo en placas de 10 cm. Incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 10 minutos. Aspirar el exceso de colágeno. Parafilm sin usar las placas y se almacenan a 4 ° C durante una semana.
8. Cambiar el soporte de 2 a 3 veces por semana. El éxito de la digestión de los tejidos se caracterizan por la presencia de focos epiteliales rodeada de husillo fibroblástica células en forma.
9. Separar los fibroblastos y las células epiteliales por tryspinization selectiva. Aspirar los medios de comunicación y se lavan las células con PBS una vez. Pipeta de 1 ml de 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA a las células y se incuban a temperatura ambiente. Los fibroblastos son más de baja adherencia de las células epiteliales. Compruebe si hay desprendimiento de fibroblastos en el microscopio después de 2 minutos, las células deben estar flotando en suspensión o detenidos, mientras que los focos epiteliales aún debe ser adherida a la superficie.
10. Golpee suavemente el plato para aflojar los fibroblastos y suavemente pipeta mls 10 de medio sin suero que contiene en el plato para eliminar los fibroblastos.
11. Pipeta de los medios que contienen fibroblastos de un tubo cónico de 15 ml y centrifugar como se describe en el paso 5). Replate estas células en colágeno recubiertas platos de 10 cm y repetir el proceso selectivo hasta tripsinización fibroblastos y células epiteliales están completamente separadas.
12. Comprobar la pureza de células por inmunofluorescencia para marcadores epiteliales tales como CK14 y CK18 y fibroblastos marcadores como la alfa actina de músculo liso (α-SMA).

3. La tinción de inmunofluorescencia de las células cultivadas

1. Cubreobjetos de vidrio en lugar de 6 platos cm. Esterilizar por exposición a rayos UV durante 5 a 10 minutos en una campana de flujo laminar.
2. Cubra el cubreobjetos con 2.1 ml de solución de trabajo de valores de colágeno durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA). Aspirar exceso.
3. Trypsinize y la placa de 200.000 células epiteliales o los fibroblastos por muestra. Agregar 5.3 ml de medio completo y se incuba durante 24 horas.
4. Aspirar los medios de comunicación, lavar las células con PBS y se fijan en metanol helado a -20 ° C durante 7 minutos.
5. Lavar las células dos veces con PBS para eliminar el etanol, y el bloqueo con 1-2 ml de PBS con 1% de SFB durante 1 hora a temperatura ambiente.
6. Con unas pinzas, retirar el cubreobjetos y colocarlo en un recipiente amplio y poco profundo cubierto con parafilm o superficie hidrofóbica otros.
7. Diluir los siguientes anticuerpos primarios 1:100 en solución de bloqueo: anti-actina de músculo liso (α-SMA, anti-CK14 (marcador epitelial basal), anti-CK18 (marcador epitelial luminal).
8. Pipetear 100 l de anticuerpos directamente sobre el cubreobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente. Incubar un cubreobjetos separadas de las células en solución de bloqueo, lo que muestra servirá como control de secundaria de anticuerpos.
9. Aspirar de anticuerpos y una pipeta de 1 ml de PBS directamente en el portaobjetos de lavar. Aspirar y repita 3-5 veces.
10. Diluir los siguientes anticuerpos secundaria en solución de bloqueo: anti-ratón Alexa 488 a 1:100, anti-ratón biotinilado a 1: 500, anti-ratón-alexa-568.
11. Envuelva el recipiente con el cubreobjetos en papel de aluminio. Pipetear 100 l de anticuerpo secundario apropiado directamente en el cubreobjetos: α-SMA con anti-ratón Alexa 568, CK 14 tinción con anti-ratón biotinilado y CK18 con el anti-ratón Alexa 488. Cubra el recipiente para proteger las muestras de la luz visible.
12. Aspirar anticuerpos y lavar con PBS como en el paso 9). Dejar las muestras en PBS, a excepción de tinción CK14.
13. Diluir estreptavidina conjugada con Alexa 568 1:500 en PBS. Se incuban las muestras teñidas con CK14 strepatividin-alexa 568 durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lavan con PBS como en el paso 9)
14. Diluir DAPI 1: 500 en PBS. Aspirar el PBS de las muestras y se incuban con DAPI durante 10 minutos RT en la oscuridad.
15. Enjuague las muestras con PBS. Pipetear 100 l de prolongar la anti-fade reactivo en portaobjetos de vidrio, a su vez el cubre más de lo que las células se enfrentan a la lámina de vidrio. Incline el cubreobjetos a un ángulo para hacer suavemente el contacto con los medios de comunicación de montaje.
16. Imagen de las muestras usando un microscopio de inmunofluorescencia. Mantener las muestras en la oscuridad para proteger la señal de inmunofluorescencia, que durará aproximadamente 2 semanas.

4. Preparación de las células de colágeno incorporados para el injerto

1. Para integrar las células de colágeno, es necesario bajar el pH del colágeno para lograr la polimerización mediante la mezcla de colágeno con una solución de configuración. Prepare la solución de configuración mediante la mezcla de 100 ml de la solución de Earl 10 veces más de sal balanceada (EBSS) con 2,45 g de NaHCO3, 7,5 ml de NaOH 1 M y 42,5 ml de agua destilada estéril. Además esterilizar mediante un tapón de botella 0,22 micrones unidad conectada a un frasco estéril.
2. Mezclar el colágeno (la concentración de las 1 mg / ml) con ajuste de la solución en un punto de partida 4: 1 relación. Para un injerto, mezclar 100 l de colágeno con 25 l de solución de configuración en un tubo eppendorf. Vortex brevemente o pipeta de la muestra arriba y abajo para mezclar perfectamente la muestra.
3. Añadir el colágeno o la solución de ajuste en incrementos de 5.10 l y mezcle bien hasta que el colorante rojo fenol en la mezcla cambia a una luz de color rosa a color naranja, lo que refleja un pH neutro. Un color amarillo indica un pH ácido, mientras que de color rosa oscuro refleja pH básico. Mantenga la mezcla en hielo para evitar la polimerización.
4. Eliminar los fibroblastos y las células epiteliales de la placa por tripsinización. En primer lugar, aspirar los medios de comunicación y lavar con 5 ml de PBS. Pipeta de 1 ml de 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA en HBSS por placa. Incubar los fibroblastos a temperatura ambiente durante 2-5 minutos. Se incuban las células epiteliales a 37 º C durante 2-6 minutos. Toque en las placas con cuidado para eliminar las células. Compruebe si hay desprendimiento con un microscope.Quench la tripsina pipeteando 9 ml de medio completo en el plato y la transferencia de las células a un tubo de 15 ml estéril cónica.
5. Sacar 50 ul y el recuento de las células por hemocitómetro. Tenga en cuenta el volumen total de células en cada tubo (10 ml).
6. Que sedimenten las células a 1500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el pellet de células y resuspender las células a una concentración de 100.000 células/100 l. Por ejemplo, volver a suspender las 500.000 células en un volumen total de 500 l de los medios de comunicación completa.
7. Mix 250.000 células del estroma (250 l) y 100.000 células tumorales (100 l) en un tubo separado. Microfuga 10 segundos a 1000 rpm, eliminar el sobrenadante con pipeta. Añadir 50 l de la solución de colágeno ajustarse a las células. Pipeta de arriba y abajo para dispersar las células por igual. Pipeta el l 50 en una placa estéril 6 cm de cultivo de tejidos para formar una gota circular. Incubar el injerto a 37 ° C durante 10 minutos para polimerizar.
8. Suavemente agregar 5 ml de medio completo en el plato por la inclinación de la placa en un ángulo y poco a poco pipetear los medios de comunicación por un lado de la placa. Incline la placa alrededor de los medios de comunicación hasta que cubre el injerto.
9. Incubar durante 24 horas a 37 ° C. Trasplante inmediato.

5. Ortóptica trasplante de células de colágeno incorporados en ratones C57BL/6J

1. Se fabrica una varilla de vidrio delgada para el trasplante. Caliente una pipeta Pasteur de vidrio con un mechero de Bunsen. Con unas pinzas, tramo final de la pipeta a 2.3 mm de espesor. Deje que se enfríe, y esterilizar en un 70% de etanol.
2. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos siguientes en autoclave y etanol al 70%: multa tijeras quirúrgicas, contundentes tijeras quirúrgicas, pinzas romas, pinzas finas, clips de la herida, la herida de primera necesidad
3. Anestesiar el uso del ratón con un 2-3% isoflurano utilizando una máquina de isoflurano basura. El promedio de velocidad de flujo de O ₂ se utiliza 1 L / min a través del cono de la nariz.
4. Coloque el ratón sobre la espalda e inmovilizar las extremidades con cinta adhesiva o extraíble. Quitar el pelo con un removedor de pelo químicos como Nair. Esterilizar el abdomen con un algodón limpiando, alternativamente, entre el 70% de etanol y betadine de una manera meta-like.
5. Sostener una parte de la piel por la glándula mamaria con fórceps romos con una mano. Con la otra mano, con contundentes tijeras quirúrgicas para realizar una T invertida-incisión entre el # 9 y # 10 pezones o # 4 y # 5 pezones de las glándulas mamarias inguinal para exponer las glándulas mamarias.
6. Haga una incisión en el bolsillo de los ganglios linfáticos o la arteria mamaria con pequeñas tijeras quirúrgicas de primavera.
7. Eliminar el injerto de colágeno de la placa de cultivo de tejido con las pinzas. Retire el exceso de líquido del injerto de colágeno suavemente frotando en una estéril limpiar y deslizar el injerto de colágeno por completo en el bolsillo con una varilla de vidrio delgada.
8. Suturar el colgajo de piel con suturas intestinales # 2 absorbibles o grapas de heridas.
9. Vamos a recuperar el ratón en la jaula.
10. Monitor de los ratones dos veces por semana como mínimo, la palpación de los tumores. Sacrificio de los ratones cuando los tumores alcanzan 1 cm de diámetro. Los tejidos de la cosecha para su análisis.

6. Los resultados representativos:

El aislamiento y la extracción de colágeno a partir de ratones C57BL/6J

Estos procedimientos han sido adaptados de ^1. La extracción de la proteína del colágeno de la cola de ratón 5.7 rinde aproximadamente 1-1,5 mg / ml en un volumen final de 6 ml, o 6-9 mg de proteína. Por coommassie bandas mancha, que corresponde a 90 kDa y 130 se detectan en los carriles de carga con muestras extraídas de la cola de ratón, lo que indica la presencia de colágeno tipo I y colágeno pro-respectivamente (Figura 1).

Aislamiento y cultivo de células de carcinoma de mama y fibroblastos de ratones C57BL/6J normales y PyVmT.

Los procedimientos se han adaptado a partir del ^2. Las células de carcinoma PyVmT y los fibroblastos se pueden distinguir por diferencias en la morfología celular y la expresión de determinados epiteliales y mesenquimales marKERS. Las células de carcinoma PyVmT se identifican por la forma de adoquines y co-expresar CK18, un marcador epitelial luminal y CK14, un marcador epitelial basal, pero no expresan α-SMA (Figura 2). Fibroblastos de mama son más grandes células con un fenotipo en forma de huso y expresan altos niveles de α-SMA, pero no expresan CK14 o CK 18 (Figura 2). Estos datos indican que más del 95% de pureza de células fibroblastos y células epiteliales utilizando los procedimientos descritos.

Ortóptica trasplante de células de colágeno incorporados en ratones C57BL/6J

Estos procedimientos han sido adaptados de ^{3, 4.} Trasplante de ratones receptores son sacrificados cuando los tumores en los grupos experimentales llegar a 1,0 cm de diámetro, o aproximadamente 60 días. Aunque el trasplante de células PyVmT solo los resultados en los tumores palpables después de 30 a 40 días, alcanzando un peso promedio de 0,335 gramos del tumor a los 60 días, co-trasplante de células de carcinoma PyVmT con los resultados de los fibroblastos de mama en una masa tumoral medio de 0.630 gramos, lo que indica la mejora del crecimiento del tumor por los fibroblastos (Figura 3).

Figura 1. Análisis de tinción de Coomassie de colágeno tipo I de extracción de la cola de ratón. BSA (~ 66 kDa), está indicado por la flecha. Colágeno comerciales cola de rata (20 mg de proteína), y el colágeno purificado cola de ratón (20 mg de proteína) se indican con caja (~ 130 kDa, ~ 90 kDa proteínas). Std = estándar de peso molecular.

Figura 2. La tinción de inmunofluorescencia de las células del donante PyVmT carcinoma de mama y fibroblastos. Paneles A y B representan PyVmT células de carcinoma de mama immunostained de anticuerpos para CK14 y CK18. Grupo C representa fibroblastos teñidos con anticuerpos α-SMA. Imágenes que se muestran con DAPI superposición de 20 aumentos.

Figura 3. El desarrollo del tumor mamario en ratones C57BL/6J en la presencia o ausencia de los fibroblastos. Los tumores mamarios fueron recolectadas de ratones transplantados con células de carcinoma PyVmT en la presencia o ausencia de fibroblastos de mama y se pesa. Media ± error estándar de la media. N = 6 por grupo.

Discusión

La contribución funcional de los fibroblastos en la progresión tumoral se ha demostrado a través de modelos de trasplante, en el que el carcinoma de fibroblastos asociados co-trasplante con resultados benignos de mama células epiteliales en un mayor crecimiento del tumor y la invasión ^5. Los enfoques convencionales de trasplante han involucrado el uso de ratones SCID o desnudo a las células de trasplante de co-estromales y epiteliales de diferentes orígenes genéticos del ratón o de diferentes especie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
C57BL/6N ratones	Harlan	N / A
MMTV-PyVmT ratones transgénicos	Jackson laboratorios	002374
De suero fetal bovino	Pescador	SH3039603PR
DMEM	VWR	10000113873
Penicilina / estreptomicina	Pescador	MT-30-001
anfotericina	pescador	BP2645-20
Amicon columnas de filtración Ultracel 50k	Millipore	UFC905008
Tubos de rotor Beckman TI	Beckman	355618
Rata cola de colágeno	Pescador	CB 40236
EBSS 10x	Sigma Aldrich	E7510-100ML
Tripsina 1X, un 0,25% en HBSS w / o calcio y magnesio	Pescador	MT-25-050-CI
Ácido acético glacial	Pescador	A491-212
Coomasie azul	Pescador	BP101 25
Tripsina	Sigma Aldrich	T3924-100ml
Colagenasa A	Sigma AldrichC0130-50
hyalronidase	Sigma Aldrich	H3884
DNasa	Sigma Aldrich	D5025
Kaleidoscope estándar de proteínas	Biorad	1610375
Portaobjetos de vidrio	Pescador	12545-78
Cubreobjetos de vidrio	VWR	101400-042
Vimentina anticuerpos S-20	Santa Cruz de Biotecnología	SC-7558
α-actina de músculo liso	Abcam	ab5694
CK14 anticuerpos	Santa Cruz de Biotecnología	sc-53253
CK18 anticuerpos	Abcam	ab668
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Anti-ratón biotinilado	Vector de laboratorios	BA9200	Distribuido a través de Fisher
Anti-ratón-alexa-568	Invitrogen	A10037
Anti-ratón-alexa-488	Invitrogen	A11001
Estreptavidina-alexa-488	Invitrogen	S11226
DAPI	Invitrogen	D21490
Prolongar Antifade	Invitrogen	P-36930
Tijeras quirúrgicas	Herramientas de Bellas Ciencia	91400-12
Tijeras finas primavera	Herramientas de Bellas Ciencia	15000-02
Blunt fórceps	Herramientas de Bellas Ciencia	11002-12
# 5 pinzas finas	Herramientas de Bellas Ciencia	11251-10
Intestino sutura crómica	Pescador	NC9326254
Pipeta Pasteur de vidrio	Pescador	22-042-815
Etanol	Pescador	A406P 4
betadine	pescador	NC9386574
Clips de la herida	Pescador	12032-07
Herida de primera necesidad	Pescador	12031-07