C57BL/6Jマウスにおける間質細胞と癌細胞の乳腺移植

要約

このレポートでは、我々はマウス乳腺から分離し、培養ドナー細胞にシステムのデモンストレーションを、と同所間質分析するためにレシピエントマウスにこれらの細胞を移植：乳腺腫瘍の開発中に上皮との相互作用を。

要約

乳腺腫瘍の進行に対する線維芽細胞を含む間質細胞の影響はよくマウスの乳腺の間質細胞と上皮細胞の移植による、特に、マウスモデルを使用して文書化されています。現在の移植モデルは、しばしば間質細胞と上皮細胞の異なる遺伝的背景に起因する免疫不全マウスの使用を必要とする。細胞外マトリックスは、しばしば一貫性のある細胞間相互作用の2つの異なった種類の細胞を埋め込むために使用されるが、免疫原性基質であるマトリゲルまたはラット尾のコラーゲンの使用を必要としている。免疫不全マウスから機能的なT細胞の欠如は、医薬品開発と有効性に関する重要な意味を持つ、 生体内での乳腺腫瘍の進行に間質細胞の正確な評価を防ぎます。また、免疫不全マウスでは、特別なケアの条件を繁殖し、必要とするのは難しい、コストがかかります。これらの障害を克服するために、我々は、同所一貫性のある腫瘍の形成を誘導するために、同じ遺伝的背景からマウスに間質細胞と上皮細胞を移植する手法を開発しました。このシステムは、ドナーC57BL/6Jマウスから通常、癌関連線維芽細胞、PyVmT乳癌細胞とコラーゲンを収穫伴います。次に、細胞をコラーゲンに埋め込まれ、雌のC57BL/6Jマウスの鼠径部乳腺に移植されています。単独でPyVmT細胞の移植は、明白な腫瘍の30〜40日後に移植を形成する。 60日でのエンドポイント解析は、その線維芽細胞との共移植が単独で移植PyVmT細胞と比較して乳腺腫瘍の成長を促進することを示します。 C57BL/6Jマウス由来の細胞とマトリックスはこれらの研究で用いていたが、細胞とマトリックスと移植のアプローチの分離は、汎用性を実証するさまざまな遺伝的背景からマウスの方に適用されることがあります。要約すると、このシステムは、間質細胞と上皮細胞間の分子間相互作用を調査するために使用すること、および免疫不全マウスモデルでの重要な限界を克服しています。

プロトコル

1。 C57BL/6Jマウスから分離し、ドナーのコラーゲンの抽出

1. 承認さIACUCの方法を使用して成熟した正常な雌C57BL/6Jマウスを生け贄に捧げる。
2. 尾を回収し、組織を滅菌するために45分間70％エタノールに浸漬。ティッシュペーパー、アルミホイルでラップと尾を乾かします。必要になるまで-20℃で尾を保管してください。
3. そのような層流フードのような無菌環境で尾を置きます。はさみを使用して、離れて尾から尾の根と皮で皮膚を分割。尾の両端0.5〜1cmを削除し、3つまたは​​4つの部分に残りの末尾を分割する。尾から腱を摘出し、メスまたはカミソリ刃を使用して、個々の繊維に腱を分離。
4. 滅菌コンテナに腱繊維を移し、滅菌蒸留水で洗ってください。 5月7日マウスの尾から/ mlペニシリンペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、250 ng / mlのアンホテリシン、および0.034 Nから希釈した酢酸を50単位を含む、35 mlの滅菌脱イオン水を含む50 mlコニカルチューブに移すの腱氷酢酸（17 N）のストック溶液。 4のロッカーの上に置いては° C週にコラーゲンを抽出する。
5. 15分3000gでテーブルトップ遠心機で破片をスピンダウンします。 1時間、35,000 G（約17000 rpm）でベックマン50.2 Tiのローターとスピンに適応twoポリカーボネートチューブに上清を、約30 MLSを転送します。
6. 上清の量は1〜2 mg / mlの濃度を達成するために縮小する必要があります。 4時15でultracel 50 Kアミコンろ過ユニットと3000rpmで、テーブルトップ遠心機でスピンして上清を移す℃に滅菌コニカルチューブにろ液を転送して保存する。ボリュームが5〜6ミリリットルになるまで遠心操作を繰り返します。
7. タンパク質濃度を読み取る。我々は、BSA標準（バイオラッド）と未希釈サンプルを用いて、標準のBradfordアッセイ（BioRad）を使用してください。ネガティブコントロールとして、あなたのろ液からサンプルを測定します。
8. さらに6％SDSポリアクリルアミドゲル、10レーン、1.5 mmのゲルの厚さでコラーゲンの精製サンプルを解決することで、抽出の純度を確認してください。 1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブの63 mMトリス塩酸、10％グリセロール、2％SDS 0.0025％ブロモフェノールブルーを含む30μlの1 × SDS - PAGEローディングバッファーでサンプル20μgのを準備します。ラット尾I型コラーゲン陽性対照としてのタンパク質の相当額を準備します。加えて、2.5でのBSAの標準のセットを準備し、5、10、PBSおよび1Xローディングバッファーに希釈した20μgの。 ℃で5分間95℃で試料を沸騰。
9. 結露をスピンダウンする（10秒間の最大速度）のサンプルは、クールと簡単に遠心してみましょう。
10. 分子量マーカーと一緒にサンプルサンプルをロードします。例えば、万華鏡バイオラッドのタンパク質標準液5μlをロードする。約1時間または色素フロントが底に達するまで、150ボルトで電気泳動させる。
11. ゲルを削除し、クマシーブルーバッファに染色。脱イオン水を含む千ミリリットルの合計体積でクマシーブルー2gの、75ミリリットル氷酢酸、500mlのエタノールを混合することにより、このバッファを準備します。また、クマシーブルー試薬がない点を除いてレシピを使用して脱色バッファの同じ量を用意する。クマシーブルーとロッカーでの場所のための十分な量でゲルをカバー。
12. RTとデカント汚れで1時間穏やかに揺らし。それはダークブルーを回す脱色液を交換してください。一晩ゲルを拘留または個々のバンドをゲル上で解決されるまで。 twoコラーゲンのバンド（分子量= 90 kDaと130 kDaの）を見つけ、標準とコントロールに対するバンドの強さに注意してください。画像ゲルdocのシステムを使用してゲルを、必要に応じて。

2。正常とPyVmT C57BL/6Jマウス由来のドナー乳癌細胞と線維芽細胞の単離および培養

1. 腫瘍が承認されたIACUCの方法を使用してPyVmTトランスジェニックマウスで明らかにし、触知である場合、生後10週間後に女性の正常またはPyVmTトランスジェニックマウスをマッチした年齢を生け贄に捧げる。
2. 平らな面に背の上でマウスを公開し、テープの接着剤を使用して手足を固定化する。
3. 胸部および鼠径部乳腺の乳首の間にT切開逆さまを作成し、乳腺を公開するために、背部皮膚のフラップを引き出します。乳腺組織を取り出して、手術用ハサミを使用して小片に刻む。
4. 200mgのトリプシン、500mgのコラゲナーゼ、4mgのDNアーゼ、37℃3時間氷してから、上で一晩滅菌PBSと抗生物質のヒアルロニダーゼ10万台℃：含む酵素消化のカクテルを100 mlを調製
5. PBSで4℃で5分間1500rpmで、テーブルトップ遠心機でそれぞれのサンプルと遠心分離、細胞ペレットに10％ウシ胎児血清（FBS）を含む10 mlの℃を追加
6. 静かに上清を吸引し、PBS/10％FBS 5-7 mlに細胞ペレットを再懸濁します。スピンを繰り返し、さらに2回洗浄する。
7. DMEMを含む10％FB 10ml中の細胞ペレットを再懸濁しますコラーゲンでコーティングプレートにコラーゲンタイプIでコートした10cmディッシュに50ユニット/ mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、250 ng / mlのアンホテリシンを含むSは、39にコラーゲンを1ml（株式は1.5 mg / mlを使用して）希釈0.02 N酢酸のmlの滅菌蒸留水またはPBSで希釈した。コラーゲンのピペットで5mlのは10cmのプレート上に溶液を取り組んでいます。 10分の最小室温でインキュベートする。過剰なコラーゲンを吸引除去する。 4℃でパラフィルム未使用の皿や店舗°週間C。
8. 週3回 - メディア2を変更。組織の成​​功消化は紡錘状の線維芽細胞に囲まれた上皮巣の存在によって特徴付けられます。
9. 選択tryspinizationによって線維芽細胞や上皮細胞を分離。培地を吸引除去し、PBSで1回細胞を洗浄。室温で細胞をインキュベート上に0.25パーセントtrypsin/0.54 mMのEDTAのピペットで1ミリリットル。線維芽細胞は、上皮細胞よりもゆるく付着しています。 2分後に顕微鏡下で線維芽細胞の剥離を確認してください。上皮巣がまだ表面に付着する必要がある一方、細胞は、懸濁液中に浮いたり、切り上げする必要があります。
10. 軽く線維芽細胞を除去するために皿に血清を含む培地の線維芽細胞と静かにピペット10mlのを緩めるために料理をタップします。
11. ピペットで、ステップ5で説明した15 mlコニカルチューブと遠心分離機で線維芽細胞を含む培地）。コラーゲンコートした10cmの皿の上にこれらの細胞をReplateと線維芽細胞や上皮細胞が完全に分離されるまで、選択的なトリプシン処理のプロセスを繰り返します。
12. このようなCK14とCK18と、アルファ平滑筋アクチン（α- SMA）のような線維芽細胞のマーカーとしての上皮マーカーのための免疫蛍光染色によって細胞の純度を確認してください。

3。培養細胞の免疫蛍光染色

1. さ6cm皿にガラスのカバースリップを配置。層流フードで5〜10分間紫外線照射による滅菌する。
2. コー​​ト室温（RT）で10分間、株式のコラーゲン溶液を、作業の1〜2 mlでカバー。過剰を吸引除去する。
3. サンプル当たり200,000上皮細胞または線維芽細胞をトリプシン処理し、プレート。完全なメディアの3-5 mlを加え24時間インキュベートする。
4. 培地を吸引除去、PBSで細胞を洗浄し、7分まで-20℃で氷冷メタノールで固定してください。
5. PBSで2回は、室温で1時間1％FBSを含む1〜2 mlのエタノール、およびブロックを削除するには、PBSで細胞を洗浄する。
6. 鉗子を使用して、パラフィルムまたは他の疎水性の表面で覆われた大きな浅い容器にカバースリップと場所を削除します。
7. 抗平滑筋アクチン（α- SMA、（基底上皮マーカー）、抗CK14、抗CK18（腔上皮マーカー）：ブロッキング溶液で1:100以下の一次抗体を希釈する。
8. 室温で1時間のための直接カバースリップ上に抗体のピペットで100μlの。ブロッキング溶液中の細胞の別々のカバースリップをインキュベートする、このサンプルでは、​​二次抗体のコントロールとして機能します。
9. 抗体とピペットで直接洗うようにカバースリップ上に1mlのPBSを吸引除去する。吸引して3-5回繰り返す。
10. 1:100での抗マウス-アレクサ488、1でビオチン化抗マウス：：500、抗マウス-アレクサ- 568ブロッキング溶液で、次の二次抗体を希釈する。
11. アルミホイルでカバーグラスでコンテナを包みます。ピペットで直接カバースリップ上の適切な二次抗体を100μl：抗マウス-アレクサ568、抗マウス-アレクサ488 CK 14ビオチン化抗マウスで染色し、CK18とα- SMA。可視光から試料を保護するための容器をカバー。
12. 抗体を吸引除去し、ステップ9）のようにPBSで洗浄する。 CK14染色を除き、PBSでサンプルを残す。
13. PBSでアレクサ568 1:500にアビジンを希釈する。暗所で室温で30分間strepatividin -アレクサ568とCK14染色サン​​プルをインキュベートする。ステップ9のようにPBSで洗浄する）
14. PBSで500：DAPI 1希釈する。サンプルからPBSを吸引除去し、暗所で10分、RTのためにDAPIでインキュベートする。
15. PBSでサンプルを洗浄します。ガラススライド上に抗フェード試薬を延長するのピペットで100μlを、細胞はスライドガラスに直面しているので、上のカバーを回します。優しくマウントメディアとの接触を下すために、単一の角度にカバースリップを傾け。
16. 免疫蛍光顕微鏡を使用してサンプル画像。約2週間持続する免疫蛍光シグナルを、保護するための試料の暗所で保管してください。

4。移植のためのコラーゲンの埋め込み細胞の調製

1. コラーゲンで細胞を埋め込むには、それは設定溶液とコラーゲンを混合することにより重合を達成するためにコラーゲンのpHを下げる必要があります。 NaHCO3水溶液の2.45グラム、1 M NaOHを7.5mlの滅菌蒸留水42.5 mlを10倍アールズ平衡塩類溶液100ml（EBSS）を混合することによって設定溶液を調製します。さらに滅菌ボトルに接続されているボトルの上部に0.22ミクロンフィルターユニットを用いて滅菌する。
2. 開始4で解決策を設定すると（ストック濃度1 mg / ml）のコラーゲンをミックス：1の割合。 one移植の場合は、エッペンドルフチュー​​ブ中の溶液を設定するの25μlとコラーゲンの100μlを混合する。軽くボルテックスまたはピサンプルを上下に徹底的にサンプルを混合する。
3. コラーゲンまたは5〜10μlの増分で設定のソリューションを追加し、中性のpHを反映して、オレンジ色にピンクの光の混合物の変更にフェノールレッド色素になるまでよく混ぜる。濃いピンクが基本的なpHを反映しながら、黄色の色は、酸性のpHを示している。重合を防止するために氷上で混合してください。
4. トリプシン処理によりプレートから線維芽細胞や上皮細胞を取り除きます。最初に、培地を吸引除去し、PBS 5mlで洗浄する。ピペットで0.25パーセントプレートあたりのHBSSでtrypsin/0.54 mMのEDTAを1ml。 2〜5分間室温で線維芽細胞をインキュベートする。 2から6分間37℃で上皮細胞をインキュベートする。細胞を緩めるために静かにプレートをタップします。プレート上に完全培地9mlのピペッティングしてmicroscope.Quenchをトリプシンを用いて剥離を確認し、滅菌15 mlコニカルチューブに細胞を移す。
5. 50μlのを削除し、血球計算盤で細胞数をカウント。各チューブ内のセルの合計量（約10ml）に注意してください。
6. 室温で5分間、1500rpmでペレットは、細胞。細胞ペレットを吸引、10万cells/100μLの濃度に細胞を懸濁します。例えば、完全なメディアの500μlの総体積で500,000個の細胞を懸濁します。
7. 別のチューブに25万ストローマ細胞（250μl）を、10万腫瘍細胞（100μl）を混合します。マイクロ10秒1000rpmで、ピペッティングにより上清を取り除く。細胞に調整したコラーゲン溶液の50μlを追加します。上下にピペットで均一に細胞を分散させる。ピペットで円形のドロップを形成するために滅菌さ6cm組織培養プレートで50μlの。 ℃で10分間重合する37移植片をインキュベートする。
8. ゆっくりと角度で傾斜板によって板で完全なメディアの5mlのを追加し、徐々にプレートの一方の側でメディアをピペッティングする。メディアが移植をカバーするまで、周りに板を傾けて。
9. 37℃で24時間インキュベート℃にすぐに移植する。

5。 C57BL/6Jマウスにおけるコラーゲン埋め込まれた細胞の視能矯正の移植

1. 移植手術のための細いガラス棒を作製。ブンゼンのバーナーを使用してガラスパスツールピペットを加熱する。鉗子を用いて、厚さ2〜3 mmまでピペットの先端を伸ばす。冷ます、および70％エタノールで滅菌。
2. 細かい外科はさみ、鈍外科はさみ、鈍鉗子、薄い鉗子、創傷クリップ、ステイプル傷：オートクレーブと70％エタノールで以下のような手術器具の滅菌
3. イソフルラン2〜3パーセントは、イソフルラン清掃機を使用して使用して、マウスを麻酔。使用される平均的なO ₂流量は、ノーズコーンを介して1 L /分です。
4. その背中にマウスを置くと、テープまたはその他のリムーバブル接着剤で手足を固定化する。このようなNairさんなどの化学脱毛剤で髪を取り外します。綿がターゲットのような形式で、70％エタノールとbetadineの間で交互にスワブで腹部を滅菌する。
5. 片手で鈍鉗子を用いて乳腺が皮膚の一部を保持する。乳腺を公開するために、＃9と＃10の乳首または＃4と＃鼠径乳腺の5乳首の間にT -切開逆さまにする鈍外科はさみを使用して、もう一方の手で。
6. 小さな外​​科春のはさみとリンパ節や乳腺動脈下のポケットの切開を行います。
7. 鉗子を用いて組織培養皿からコラーゲンの移植片を取り外します。軽く拭くと細いガラス棒を使用してポケットに完全にコラーゲンの移植片をスライドさせ、滅菌に軽くたたくことによってコラーゲンの移植片から余分な液体を取り除く。
8. 第2位腸吸収性縫合糸や創傷ステープルを使用して皮弁を縫合。
9. マウスがケージにリカバリできます。
10. 腫瘍に対する触診、最低でも週2回マウスを監視します。腫瘍が直径1cmに達すると、マウスを犠牲にする。分析のための組織を採取する。

6。代表的な結果：

C57BL/6Jマウスから分離し、コラーゲンの抽出

これらの手順は^、1から採用されました。タンパク質の9ミリグラム - 5月7日のマウスの尾からのコラーゲンタンパク質の抽出は、約1〜1.5 6ミリリットル最終体積mg / mlの、または6が得られます。染色coommassieによって、90 kDaと130 kDaのに相当するバンドは、それぞれI型コラーゲンとプロコラーゲン（図1）の存在を示す、マウスの尾から抽出したサンプルをロード車線で検出されています。

正常とPyVmT C57BL/6Jマウス由来の乳癌細胞と線維芽細胞の分離および培養。

手順は²から採用されました。 PyVmT癌細胞と線維芽細胞は、特定の上皮と間葉月の細胞の形態及び発現の違いによって区別す​​ることができますKERS。 PyVmT癌細胞は、敷石の形状と共発現CK18、腔上皮マーカーとCK14、基底上皮マーカーではなく、明示α- SMA（図2）によって識別されます。乳腺線維芽細胞は、紡錘状の表現型を持つ大きな細胞であり、α- SMAの高レベルで発現がCK14またはCK 18（図2）を発現しない。これらのデータは、概略を述べた方法を使って、線維芽細胞や上皮細胞に対する95％の細胞の純度を介して示している。

C57BL/6Jマウスにおけるコラーゲン埋め込まれた細胞の視能矯正の移植

これらの手順は^、3、4から採用されました。移植レシピエントマウスは、どちらの実験群における腫瘍は直径で1.0 cm、または約60日に到達したときに犠牲にされています。 30日以降に明白な腫瘍の一人でPyVmT細胞結果の移植ながら - 40日は、60日に0.335グラムの平均腫瘍塊に達し、0.630グラムの平均腫瘍塊における乳腺線維芽細胞の結果とPyVmT癌細胞の共移植は、増強を示す線維芽細胞（図3）による腫瘍増殖の。

図1。コラーゲンI型マウスの尾から抽出のクマシー染色分析。BSAは（〜66 kDa）は矢印で示されます。商業ラット尾コラーゲン（20μgのタンパク質）、および精製されたマウスの尾のコラーゲン（20μgのタンパク質が）ボックス（〜130 kDaの、〜90 kDaのタンパク質）で示されます。 STD =分子量標準。

図2。ドナーPyVmT乳腺癌細胞と線維芽細胞の免疫蛍光染色。パネルAおよびBは、CK14とCK18の抗体を免疫染色PyVmT乳癌のセルを表します。パネルCは、α- SMAに対する抗体で染色された線維芽細胞を表しています。画像は20倍の倍率でDAPIオーバーレイで表示。

図3。線維芽細胞の存在下又は非存在下でC57BL/6Jマウスの乳腺腫瘍の開発。乳腺腫瘍は、乳腺線維芽細胞の存在下または非存在下でPyVmT癌細胞を移植したマウスから採取し、秤量した。意味+平均値の標準誤差を。 N =グループあたり6。

ディスカッション

腫瘍の進行における線維芽細胞の機能的な貢献は、癌関連した線維芽細胞が増加した腫瘍の増殖と浸潤⁵の良性乳腺上皮細胞の結果と同じ場所に移植した、移植モデルによって実証されている。従来の移植のアプローチは、異なる遺伝的マウスの背景や異なる種からの共移植間質および上皮細胞のSCIDまたはヌードマウスの使用が関与している。免疫不全マウスでは腫瘍特異的抗原と腫...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
C57BL/6Nマウス	ハーラン	N /
MMTV - PyVmTトランスジェニックマウス	ジャクソン研究所	002374
ウシ胎仔血清	フィッシャー	SH3039603PR
DMEM	VWR	10000113873
ペニシリン/ストレプトマイシン	フィッシャー	MT - 30から001
アンフォテリシン	漁師	BP2645 - 20
アミコンろ過カラムultracel 50K	ミリポア	UFC905008
ベックマンTIローター用チューブ	ベックマン	355618
ラットの尾のコラーゲン	フィッシャー	CB 40236
10倍EBSS	シグマアルドリッチ	E7510 - 100ML
トリプシン1X、HBSS W / Oカルシウムとマグネシウム0.25％	フィッシャー	MT - 25 - 050 - CI
氷酢酸	フィッシャー	A491 - 212
Coomasie青	フィッシャー	BP101 25
トリプシン	シグマアルドリッチ	T3924 - 100ミリリットル
コラゲナーゼ	シグマAldrichC0130 - 50
hyalronidase	シグマアルドリッチ	H3884
DNase処理	シグマアルドリッチ	D5025
万華鏡のタンパク質標準	バイオラッド	1610375
スライドガラス	フィッシャー	12545〜78
ガラス製カバースリップ	VWR	101400-042
ビメンチン抗体S - 20	サンタクルスバイオテクノロジー	SC - 7558
α-平滑筋アクチン抗体	アブカム	ab5694
CK14抗体	サンタクルスバイオテクノロジー	SC - 53253
CK18抗体	アブカム	ab668
DAPI	シグマアルドリッチ	D9542
抗マウスビオチン化	ベクターラボラトリーズ	BA9200	フィッシャーを通じて配布
抗マウス-アレクサ- 568	インビトロジェン	A10037
抗マウス-アレクサ- 488	インビトロジェン	A11001
ストレプトアビジン-アレクサ- 488	インビトロジェン	S11226
DAPI	インビトロジェン	D21490
退色を長引かせる	インビトロジェン	P - 36930
外科はさみ	ファイン科学ツール	91400〜12
春のはさみ	ファイン科学ツール	15000〜02
ブラント鉗子	ファイン科学ツール	11002〜12
＃5微細な鉗子	ファイン科学ツール	11251〜10
腸クロム縫合	フィッシャー	NC9326254
ガラスパスツールピペット	フィッシャー	22-042-815
エタノール	フィッシャー	A406P 4
betadine	漁師	NC9386574
創傷クリップ	フィッシャー	12032〜07
創傷主食	フィッシャー	12031〜07