Молочные трансплантации стромальных клеток и клетки карциномы у мышей C57BL/6J

Резюме

В этом докладе, мы демонстрируем системы, чтобы изолировать и культуры донорских клеток от мышей молочной железы, и orthotopically трансплантации этих клеток мышам-получателей, чтобы проанализировать стромальных: эпителиальных взаимодействий в молочных развития опухоли.

Аннотация

Влиянием стромальных клеток, включая фибробласты на молочные прогрессии опухоли были хорошо документированы с помощью мыши моделей, в частности, путем трансплантации стромальных клеток и клеток эпителия молочной железы мышей. Современные модели трансплантации часто связаны с использованием иммунитетом мышей из-за различных генетических особенностей, характерных для клетки стромы и эпителиальных клеток. Внеклеточной матрицы часто используется для внедрения двух различных типов клеток для последовательного межклеточных взаимодействий, но связаны с использованием Матригель или крысы хвост коллагена, которые иммуногенных субстратов. Отсутствие функциональной Т-клеток от мышей иммунитетом предотвращает точную оценку стромальных клеток опухоли молочной железы на прогрессию в живом организме, что имеет важные последствия на развитие и эффективность лекарств. Более того, ослабленным иммунитетом мышей являются дорогостоящими, трудно породы и требуют особых условий ухода. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы разработали подход к orthotopically трансплантации стромальных клеток и эпителиальных клеток мышам с того же генетического фона, чтобы вызвать последовательное формирование опухоли. Эта система включает в себя уборка нормальная, рак связаны фибробластов, PyVmT клетки молочной железы рак и коллаген-доноров мышам C57BL/6J. Затем клетки встроенных в коллагене и пересадить в паховых молочных желез самок мышей C57BL/6J. Трансплантация PyVmT клетки только форма ощутимой опухоли 30-40 дней после пересадки. Endpoint анализ на 60 дней показывает, что совместное трансплантации фибробластов усиливает рост опухоли молочной сравнению с PyVmT клетки трансплантировали в одиночку. Хотя клетки и матрицы от мышей C57BL/6J были использованы в этих исследованиях, изоляции клеток и матричных и трансплантации подход может быть применен к мышей от различных генетических фоны демонстрируя универсальность. Таким образом, эта система может быть использована для исследования молекулярных взаимодействий между клетками стромы и эпителиальных клеток, и преодолевает ограничения критических с ослабленным иммунитетом модели мыши.

протокол

1. Выделение и извлечение доноров коллагена от мышей C57BL/6J

1. Жертва зрелых нормальных самок мышей C57BL/6J с использованием утвержденных IACUC методами.
2. Урожай хвосты и замочить в 70% этаноле в течение 45 минут для стерилизации тканей. Сухие хвосты с папиросную бумагу, завернуть в алюминиевую фольгу. Магазин хвосты от -20 ° C до необходимости.
3. Место хвосты в стерильной среде, таких как капот ламинарного потока. Использование ножницы, сплит кожу корня хвоста и очистить от хвоста. Удалить 0,5 до 1 см с обоих концов хвост и разделить оставшиеся хвост на три или четыре части. Рассекают сухожилия с хвостами и отдельные сухожилия на отдельные волокна с помощью скальпеля или лезвия бритвы.
4. Передача сухожилия волокон стерильный контейнер и промыть стерильной дистиллированной водой. Трансфер из сухожилий хвоста 5-7 мышей 50 мл коническую трубку с 35 мл стерильной деионизированной воды, содержащей 50 ед / мл пенициллина пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 250 нг / мл амфотерицина, и 0,034 N разбавленной уксусной кислотой из маточный раствор ледяной уксусной кислоты (17 N). Место на рокера при 4 ° С в течение недели, чтобы извлечь коллаген.
5. Спином вниз мусора в столешнице центрифуге при 3000 г в течение 15 минут. Передача супернатант, примерно 30 мл до двух поликарбонатные трубы адаптированы для Бекман 50,2 Ti ротора и спина в 35000 г (примерно 17000 оборотов в минуту) в течение 1 часа.
6. Объем супернатанта должна быть уменьшена до достижения концентрации 1-2 мг / мл. Передача супернатант к ultracel 50 к Amicon блок фильтрации и спина в столешнице центрифуге при 3000 оборотов в минуту в течение 15 при 4 ° C. Передача фильтрата стерильные конические трубки и сохранить. Повторите центрифугирования пока объем уменьшается до 5-6 мл.
7. Прочитано концентрации белка. Мы используем стандартные Бредфорда (Biorad), используя стандарты BSA (Biorad) и неразбавленный образцов. Мера выборки из вашего фильтрата, в качестве отрицательного контроля.
8. Дальнейшая проверка чистоты добычи путем разрешения образца очищенного коллагена на 6% SDS полиакриламидном геле, 10 переулков, 1,5 мм толщины геля. Подготовка 20 мкг образца в 30 мкл 1x SDS-PAGE загрузки буфера, содержащего 63 мМ Трис-HCl 10% глицерина, 2% SDS 0,0025% бромфенолового синего в 1,5 мл пробирок Эппендорф. Подготовка эквивалентное количество белка из крысиного хвоста коллагена типа I в качестве положительного контроля. Кроме того, подготовить набор стандартов BSA в 2,5, 5, 10, 20 мкг разводят в PBS и 1X загрузки буфера. Отварите образцов при 95 ° С в течение 5 минут.
9. Пусть образцы прохладно и кратко микроцентрифужную (максимальная скорость в течение 10 секунд) для замедления вращения конденсации.
10. Загрузите образцы образцы наряду с маркер молекулярного веса. Например, нагрузка 5 мкл Калейдоскоп стандартных белков Biorad. Electrophorese при 150 вольт в течение приблизительно 1 часа или пока краска фронт достигнет дна.
11. Удаление геля и пятна в буфере Кумасси синий. Подготовка этого буфера путем смешивания 2 г Кумасси синий, 75 мл ледяной уксусной кислоты, 500 мл этанола в общем объеме 1000 мл, содержащих де-ионизированной воды. Также приготовьте такое же количество destain буфера, используя рецепт только без реагента Кумасси синий. Обложка гель с достаточным объемом для Кумасси синий и место на рокера.
12. Рок мягко в течение 1 часа при комнатной температуре и переливать пятно. Замените destain решение, когда оно становится темно-синим. Задержать гель на ночь или до отдельных полос решаются на геле. Найдите два коллагена полос (молекулярный вес = 90 кДа и 130 кДа) и обратите внимание на прочность полос от стандартов и контроля. Изображение геля с помощью системы гель документ, в случае необходимости.

2. Выделение и культуры донорских клеток молочной железы рак и фибробласты из нормальной и PyVmT мышей C57BL/6J

1. Жертва соответствующей возрастной женщины нормальным или PyVmT трансгенных мышей после 10-недельного возраста, когда опухоли являются очевидными и ощутимыми в PyVmT трансгенных мышей с использованием утвержденных IACUC методами.
2. Expose мыши на спине на плоской поверхности и иммобилизации конечностей использования клейкой ленты.
3. Сделать с ног на голову T разрез между соски грудной и паховых молочных желез и тянуть обратно кожный лоскут, чтобы разоблачить молочных желез. Удаление молочных тканей и фарш на небольшие части, используя хирургические ножницы.
4. Подготовка 100 мл ферментативного переваривания коктейль, содержащий: 200 мг трипсин, коллагеназа 500 мг, 4 мг ДНКазы, 100000 единиц гиалуронидазы в стерильном PBS и антибиотиками всю ночь на льду, а затем в течение 3 часов при температуре 37 ° C.
5. Добавьте 10 мл PBS, содержащего 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) для каждого образца и центрифуги осадок клеток в столешнице центрифуге при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут при 4 ° C.
6. Аккуратно аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5-7 мл PBS/10% FBS. Повторите спина и мыть два раза.
7. Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS, содержащий 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 250 нг / мл амфотерицина на 10 см блюда покрыта коллагена типа I. Для пальто пластин с коллагеном, развести коллагена 1 мл (с использованием фондовых 1,5 мг / мл) на 39 мл 0,02 N уксусной кислоты растворяют в стерильной дистиллированной воде или PBS. Внесите 5 мл коллагена рабочего раствора на 10 см пластин. Инкубируйте при комнатной температуре в течение минимум 10 минут. Аспирируйте избыточного коллагена. Парафильмом неиспользованных плит и хранить при 4 ° С в течение недели.
8. Изменение СМИ 2 - 3 раза в неделю. Успешное усвоение тканями будет характеризоваться наличием эпителиальных очагов окружении веретенообразную форму фибробластов клеток.
9. Отдельные фибробласты и эпителиальные клетки селективным tryspinization. Аспирируйте СМИ и промыть клетки с PBS один раз. Внесите 1 мл 0,25% trypsin/0.54 мМ ЭДТА на клетки и инкубировать при комнатной температуре. Фибробласты более свободно, чем приверженец эпителиальных клеток. Проверьте фибробластов отряд под микроскопом в течение 2 минут, клетки должны быть плавающие в суспензии или окружены в то время как эпителиальные очагов все равно должны быть привязаны к поверхности.
10. Слегка нажмите на блюдо, чтобы ослабить фибробластов и осторожно пипеткой 10 мл сыворотки, содержащей среды в блюдо, чтобы удалить фибробластов.
11. Внесите средах, содержащих фибробласты в 15 мл коническую трубку и центрифуги, как описано в шаге 5). Replate этих клеток на коллаген покрытием 10 блюд см и повторить процесс отбора трипсинизации до фибробласты и эпителиальные клетки полностью разделены.
12. Проверьте чистоту ячейки с помощью иммунофлуоресценции окрашивание на эпителиальные маркеры, такие как CK14 и CK18 и фибробластов маркеров, таких как альфа-актин гладких мышц (α-SMA).

3. Иммунофлуоресценции окрашивания культивируемых клеток

1. Место стекла покровные в 6 см блюд. Стерилизовать ультрафиолетового облучения от 5 до 10 минут в ламинарном боксе.
2. Пальто покровное с 1-2 мл рабочего раствора фондовом коллагена в течение 10 минут при комнатной температуре (RT). Аспирируйте избытке.
3. Trypsinize и пластины 200000 эпителиальных клеток или фибробластов на образец. Добавить 3-5 мл полной среды и инкубировать в течение 24 часов.
4. Аспирируйте СМИ, мыть клетки с PBS и исправить в ледяной метанола при температуре -20 ° С в течение 7 минут.
5. Вымойте клеток с PBS в два раза, чтобы удалить этанол, и блок с 1-2 мл PBS, содержащего 1% FBS в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Использование щипцов, удалите покровные и место в большой мелкий контейнер покрытый парафильмом или другой поверхности гидрофобной.
7. Развести следующих первичных антител 1:100 в блокировании решения: анти-актин гладких мышц (α-SMA, анти-CK14 (базальной эпителиальной маркер), анти-CK18 (просвета эпителиальных маркеров).
8. Внесите 100 мкл антител непосредственно на покровных в течение 1 часа при комнатной температуре. Инкубируйте отдельных покровное клеток в блокировании решения; этот пример будет служить в качестве вторичного контроля антител.
9. Аспирируйте антител и пипетки 1 мл PBS прямо на покровное мыть. Аспирацию и повторите 3-5 раз.
10. Развести следующие вторичные антитела в блокировании решения: анти-мышь-Alexa 488 в 1:100, антимышиным биотинилированного на 1: 500, анти-мышь-Alexa-568.
11. Заверните контейнер с покровных в алюминиевую фольгу. Внесите 100 мкл соответствующего вторичного антитела непосредственно на покровные: α-SMA с анти-мышь-Alexa 568, CK 14 окрашивания антимышиным биотинилированного и CK18 с анти-мышь-Alexa 488. Крышка контейнера для защиты образца от видимого света.
12. Аспирируйте антител и промыть PBS, как в пункте 9). Оставьте образцов в PBS, за исключением CK14 окрашивания.
13. Развести стрептавидин конъюгированные с Alexa 568 1:500 в PBS. Инкубируйте CK14 окрашенных образцов с strepatividin-Alexa 568 в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Стирать в PBS, как в пункте 9)
14. Развести DAPI 1: 500 в PBS. Аспирируйте PBS из образцов и инкубировать с DAPI в течение 10 минут РТ в темноте.
15. Промыть образцов с PBS. Внесите 100 мкл Продли анти-Fade реагента на стеклах, повернуть покровное над тем, что клетки, стоящие перед стекло. Tilt покровное к одним углом, чтобы аккуратно установить контакт с монтажа средств массовой информации.
16. Изображение образцов с использованием иммунофлюоресценции микроскопом. Храните образцы в темноте, чтобы защитить иммунофлюоресценции сигнал, который продлится около 2 недель.

4. Подготовка коллагена встроенных клетки для пересадки

1. Чтобы внедрить в клетки коллагена, необходимо снизить рН коллагена для достижения полимеризации путем смешивания коллагена с настройки решения. Подготовка настройка решения путем смешивания 100 мл сбалансированного солевого раствора 10X Графа (EBSS) с 2,45 г NaHCO3, 7,5 мл 1 М NaOH и 42,5 мл стерильной дистиллированной воды. Далее стерилизовать используя бутылку верхней 0,22 микрон фильтр прилагается к стерильной бутылке.
2. Mix коллагена (фондовый концентрации 1 мг / мл) с установкой решение по стартовой 4: 1 отношение. С одной стороны трансплантата, смешать 100 мкл коллагена с 25 мкл установка решения в трубке Эппендорф. Кратко Vortex или пипеткой образец вверх и вниз, перемешать образец тщательно.
3. Добавить коллагена или установки решения на 5-10 мкл шагом и тщательно перемешать до фенола красного красителя в смеси изменений в светло-розового до оранжевого цвета, отражающие нейтральным рН. Желтый цвет указывает на кислую рН в то время как темно-розовый, отражает основные рН. Держите смесь на лед, чтобы предотвратить полимеризацию.
4. Удалить фибробласты и эпителиальные клетки пластины трипсинизации. Во-первых, аспирация СМИ и промыть 5 мл PBS. Внесите 1 мл 0,25% trypsin/0.54 мМ ЭДТА в HBSS на чашку. Инкубируйте фибробластов при комнатной температуре в течение 2-5 минут. Инкубируйте эпителиальных клеток при 37 ° С в течение 2-6 минут. Нажмите пластин осторожно, чтобы ослабить клеток. Проверьте отряд использованием microscope.Quench трипсина с помощью пипетки 9 мл полной среды на тарелку и передачи клеткам стерильные 15 мл коническую трубку.
5. Удалить 50 мкл и считать клеток гемоцитометра. Обратите внимание, общий объем клеток в каждую пробирку (примерно 10 мл).
6. Гранул клеток при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте осадок клеток и ресуспендируйте клетки концентрация 100000 cells/100 мкл. Например, ресуспендируют 500000 клеток в общем объеме 500 мкл полной информации.
7. Смешать 250 000 стромальных клеток (250 мкл) и 100000 опухолевых клеток (100 мкл) в отдельном трубки. Микроцентрифужную 10 с 1000 оборотов в минуту, удалить супернатант с помощью пипетки. Добавить 50 мкл регулируется решением коллагена в клетках. Внесите вверх и вниз, чтобы разогнать клетки равномерно. Внесите 50 мкл в стерильные 6 см планшета для культуры ткани образуют круговой капли. Инкубируйте трансплантата при 37 ° С в течение 10 минут к полимеризации.
8. Аккуратно добавить 5 мл полной среды в пластине за счет наклона пластины под углом и медленно пипетирования СМИ одной стороне пластины. Наклон пластины вокруг, пока СМИ освещают трансплантата.
9. Инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 ° C. Пересадка сразу.

5. Ортоптическое трансплантации коллагена встроенных клеток у мышей C57BL/6J

1. Изготовление тонкой стеклянной палочки для трансплантационной хирургии. Тепло пипетки Пастера стекла использованием горелки Бунзена. Использование щипцов, стрейч конца пипетки из до 2-3 мм в толщину. Дайте остыть, и стерилизовать на 70% этанола.
2. Стерилизовать следующие хирургические инструменты в автоклаве и 70% этилового спирта: изобразительное хирургических ножниц, тупая хирургические ножницы, пинцеты тупой, тонкие щипцы, раны клипы, раны основных
3. Анестезию мыши, используя с 2-3% изофлуран использованием изофлуран очистки машины. Средний O ₂ скорость потока используется 1 л / мин через носовой обтекатель.
4. Положите мыши на его спине и иммобилизации конечностей с лентой или другой съемный клей. Удалить волосы с химической удаления волос, таких как Наир. Стерилизовать живота с хлопком моечные альтернативно от 70% этанола и бетадин в целевой подобным же образом.
5. Держитесь части кожи молочной железы использованием тупых щипцы с одной стороны. С другой стороны, используя тупые ножницы хирургические, чтобы с ног на голову Т-разрез между # 9 и # 10 сосков или # 4 и # 5 соски паховых молочных желез подвергать молочных желез.
6. Сделать карманные разрез под лимфатических узлов или молочных артерии с небольшими хирургическими ножницами весной.
7. Удалить из коллагена трансплантата блюдо культуры тканей использованием щипцов. Удалите излишки жидкости из коллагена трансплантата, аккуратно вытирая на стерильной вытереть и слайд коллагена трансплантат полностью в карман с помощью тонкой стеклянной палочки.
8. Шовный кожный лоскут с помощью # 2 кишки рассасывающиеся нити или рана скоб.
9. Пусть мыши восстанавливаться в клетке.
10. Монитор мыши два раза в неделю, как минимум, для пальпации опухолей. Жертва мышей, когда опухоль достигает 1 см в диаметре. Урожай тканей для анализа.

6. Представитель Результаты:

Выделение и извлечение коллагена от мышей C57BL/6J

Эти процедуры были адаптированы из ^1. Добыча белка коллагена от 5-7 хвостов мышей дает примерно 1-1,5 мг / мл в 6 мл конечного объема, или 6 - 9 мг белка. По coommassie пятна, полосы, соответствующие 90 кДа и 130 кДа обнаружены в переулках загружены образцы, извлеченные из хвостов мышей, что указывает на наличие коллагена типа I и про-коллагеновые соответственно (рис. 1).

Выделение и культуры клеток молочной железы рак и фибробласты из нормальной и PyVmT мышей C57BL/6J.

Процедуры были адаптированы из ^2. PyVmT карциномы клеток и фибробластов можно выделить различия в морфологии клеток и экспрессии специфических эпителиальных и мезенхимальных рынковKERS. Клетки карциномы PyVmT идентифицируются по форме булыжника и со-экспресс CK18, просвета эпителиальных маркеров и CK14, базальной эпителиальной маркер, но не выразить α-SMA (рис. 2). Молочные фибробласты больше клеток с фенотипом веретенообразную форму и выразить высокие уровни α-SMA, но не выражают CK14 или CK 18 (рис. 2). Эти данные свидетельствуют о более чем 95% чистоты ячейки для фибробластов и эпителиальных клеток с использованием изложенных процедур.

Ортоптическое трансплантации коллагена встроенных клеток у мышей C57BL/6J

Эти процедуры были адаптированы из ^{3, 4.} Трансплантация получателя мышей приносятся в жертву, когда опухоли в любой экспериментальной группы достигают 1,0 см в диаметре, или примерно 60 дней. Хотя трансплантация PyVmT клетки только приводит к ощутимой опухоли после 30 - 40 дней, достигая средней опухоли массой 0,335 грамма на 60 дней, со-трансплантация PyVmT клетки карциномы молочной с результатами фибробластов в средней опухоли массой 0,630 грамма, что указывает на повышение опухолевого роста фибробластов (рис. 3).

Рисунок 1. Кумасси пятно анализ коллагена типа I извлечения из мышь хвосты. BSA (~ 66 кДа) отмечен стрелкой. Коммерческая коллагена хвоста крысы (20 мкг белка), и очищенный коллаген мышь хвоста (20 мкг белка) обозначены поле (~ 130 кДа, ~ 90 кДа белков). Std = молекулярная стандартного веса.

Рисунок 2. Иммунофлуоресценции окрашивание доноров PyVmT клетки молочной железы рак и фибробластов. Панели и б представляют PyVmT клетки молочной железы рак immunostained на наличие антител к CK14 и CK18. Группа с представляет фибробластов окрашивали антителами к α-SMA. Изображения отображаются с DAPI наложения на 20-кратным увеличением.

Рисунок 3. Молочные развития опухоли у мышей C57BL/6J в наличии или отсутствии фибробластов. Опухолей молочной железы были собраны от мышей, пересаженных с клетками карциномы PyVmT в наличии или отсутствии молочных фибробластов и взвешивали. Средний + стандартная ошибка среднего. N = 6 в группе.

Обсуждение

Функциональный вклад фибробластов в опухолевой прогрессии была продемонстрирована на основе моделей трансплантации, в которых рак связаны фибробластов совместно с пересаженной доброкачественные эпителиальные клетки результатов в увеличении роста опухоли и инвазивности ^5. Тр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
C57BL/6N мышей	Харлан	N / A
MMTV-PyVmT трансгенных мышей	Джексон лабораторий	002374
Эмбриональной телячьей сыворотки	Рыболов	SH3039603PR
DMEM	VWR	10000113873
Пенициллин / стрептомицин	Рыболов	MT-30-001
амфотерицин	рыболов	BP2645-20
Amicon фильтрации столбцов ultracel 50k	Millipore	UFC905008
Трубы для Бекман TI ротора	Бекман	355618
Коллаген крысиного хвоста	Рыболов	CB 40236
10x EBSS	Sigma Aldrich	E7510-100мл
Трипсин 1X, 0,25% в HBSS без кальция и магния	Рыболов	МТ-25-050-CI
Ледяная уксусная кислота	Рыболов	A491-212
Coomasie синий	Рыболов	BP101 25
Трипсин	Sigma Aldrich	T3924-100мл
Коллагеназа	Sigma AldrichC0130-50
hyalronidase	Sigma Aldrich	H3884
ДНКазы	Sigma Aldrich	D5025
Стандартный калейдоскоп белка	Biorad	1610375
Стекло слайдов	Рыболов	12545-78
Стекла покровные	VWR	101400-042
Виментин антител S-20	Санта-Крус биотехнологии	SC-7558
α-актин гладких мышц антител	Abcam	ab5694
CK14 антител	Санта-Крус биотехнологии	SC-53253
CK18 антител	Abcam	ab668
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Анти-мышь биотинилированного	Векторные лабораторий	BA9200	Распределенные по Фишеру
Анти-мышь-Alexa-568	Invitrogen	A10037
Анти-мышь-Alexa-488	Invitrogen	A11001
Стрептавидин-Alexa-488	Invitrogen	S11226
DAPI	Invitrogen	D21490
Продлите antifade	Invitrogen	P-36930
Хирургические ножницы	Инструменты изобразительных наук	91400-12
Изобразительное ножницы весны	Инструменты изобразительных наук	15000-02
Блант щипцы	Инструменты изобразительных наук	11002-12
# 5 тонких щипцов	Инструменты изобразительных наук	11251-10
Шовный Gut хромовой	Рыболов	NC9326254
Стекло Пастера пипетки	Рыболов	22-042-815
Этанол	Рыболов	A406P 4
бетадин	рыболов	NC9386574
Рана клипы	Рыболов	12032-07
Рана основных	Рыболов	12031-07