Transplante mamária de células estromais e células de carcinoma em camundongos C57BL/6J

Resumo

Neste relatório, nós demonstramos um sistema para isolar e cultura de células de doadores da glândula mamária do mouse, e ortotopicamente transplante dessas células em ratos para analisar estroma destinatário: interações epiteliais durante o desenvolvimento do tumor mamário.

Resumo

A influência das células do estroma, incluindo fibroblastos na progressão do tumor mamário tem sido bem documentada por meio do uso de modelos de mouse, em particular através de transplante de células do estroma e células epiteliais na glândula mamária de camundongos. Modelos atuais de transplante freqüentemente envolvem o uso de camundongos imunocomprometidos devido à diferentes origens genéticas das células do estroma e células epiteliais. Matrizes extracelulares são muitas vezes utilizados para incorporar os dois tipos de células diferentes para consistentes interações célula-célula, mas envolvem o uso de Matrigel ou colágeno da cauda de rato, que são substratos imunogênica. A falta de funcionais de células T de camundongos imunocomprometidos impede uma avaliação precisa das células estromais sobre a progressão do tumor mamário in vivo, com importantes implicações no desenvolvimento de medicamentos e eficácia. Além disso, os camundongos imunocomprometidos são caras, difíceis de produzir e requerem condições de cuidados especiais. Para superar estes obstáculos, temos desenvolvido uma abordagem para transplante de células do estroma ortotopicamente e células epiteliais em camundongos da mesma origem genética para induzir a formação de tumor consistente. Este sistema envolve a coleta normal, os fibroblastos carcinoma associados, PyVmT células de carcinoma de mama e de colágeno de camundongos C57BL/6J doador. As células são então incorporados em colágeno e transplantadas nas glândulas mamárias inguinais de camundongos fêmeas C57BL/6J. Transplante de células PyVmT sozinho formar tumores palpáveis ​​pós-transplante 30-40 dias. Análise Endpoint menos 60 dias indica que co-transplante com fibroblastos aumenta o crescimento do tumor mamário em comparação com as células transplantadas PyVmT sozinho. Enquanto as células e matriz de camundongos C57BL/6J foram utilizadas nesses estudos, o isolamento de células e matriz e abordagem transplante pode ser aplicado para ratos de diferentes origens genéticas demonstrando versatilidade. Em resumo, este sistema pode ser usado para investigar as interações moleculares entre as células do estroma e células epiteliais, e supera as limitações críticos em modelos de ratos imunocomprometidos.

Protocolo

1. Isolamento e extração de colágeno de doadores de camundongos C57BL/6J

1. Sacrifício madura fêmeas normais C57BL/6J usando métodos aprovados IACUC.
2. Colher as caudas e mergulhar em etanol 70% por 45 minutos para esterilizar tecidos. Seque o rabo com papel de seda, embrulhe em papel alumínio. Armazenar os rabos em -20 ° C até ser necessário.
3. Coloque o rabo em um ambiente estéril, como uma capela de fluxo laminar. Com uma tesoura, divida a pele na raiz da cauda e se desfazer da cauda. Remover 0,5 a 1 cm de ambas as extremidades da cauda e dividir o restante da cauda em três ou quatro peças. Dissecar os tendões da cauda e separar os tendões em fibras individuais utilizando uma lâmina de bisturi ou navalha.
4. Colocar as fibras do tendão a um recipiente estéril e lavar com água destilada estéril. Transferência de tendões da cauda de camundongos 5-7 a um tubo de 50 ml contendo 35 ml estéril água desionizada contendo 50 unidades / ml de penicilina penicilina, estreptomicina 50 mg / ml e 250 ng / ml anfotericina e 0,034 N em ácido acético diluído a partir de uma solução estoque de ácido acético glacial (17 N). Lugar no rocker a 4 ° C por uma semana para extrair o colágeno.
5. Spin down detritos em uma centrífuga de mesa em 3000 g por 15 minutos. Transfira o sobrenadante, cerca de 30 mls de dois tubos de policarbonato adaptado para o rotor Beckman Ti 50,2 e girar a 35.000 g (cerca de 17.000 rpm) por 1 hora.
6. O volume do sobrenadante terá de ser reduzido a obter uma concentração de 1-2 mg / ml. Transfira o sobrenadante para um 50 k ultracel unidade de filtragem Amicon e girar em uma centrífuga de bancada a 3000 rpm por 15 a 4 ° C. Transferir o filtrado para um tubo cônico estéril e salvar. Repetir a centrifugação até que o volume é reduzido para 5-6 ml.
7. Leia a concentração de proteína. Usamos um padrão Bradford ensaio (BioRad), usando BSA padrões (BioRad) e amostras não diluídas. Medir uma amostra do seu filtrado, como controle negativo.
8. Ainda verificar a pureza de extração por resolver uma amostra de colágeno purificado em gel de poliacrilamida 6% SDS, 10 pistas, 1,5 espessura gel mm. Prepare 20 mg de amostra em 30 mL de tampão de carregamento 1x SDS-PAGE contendo 63 mM Tris HCl 10% glicerol, 2% SDS azul de bromofenol 0,0025% em tubos de 1,5 ml eppendorf. Prepare uma quantidade equivalente de proteína de colágeno tipo rabo de rato eu, como um controle positivo. Além disso, preparar um conjunto de padrões de BSA a 2,5, 5, 10, 20 mg diluídos em PBS e tampão de carregamento 1X. Ferva as amostras a 95 ° C por 5 minutos.
9. Deixe esfriar e as amostras brevemente microcentrífuga (velocidade máxima por 10 segundos) para girar a condensação.
10. Carregar as amostras amostras, juntamente com um marcador de peso molecular. Por exemplo, coloque 5 mL de Kaleidoscope padrão de proteína Biorad. Electroforese em 150 volts por aproximadamente 1 hora ou até que a frente de corante atinge o fundo.
11. Remover o gel e mancha no coomassie tampão azul. Prepare este buffer através da mistura de 2 g de coomassie azul, 75 ml de ácido acético glacial, 500 ml de etanol em um volume total de 1000 ml contendo água desionizada. Também preparar a mesma quantidade de tampão destain usando a receita exceto sem coomassie reagente azul. Cobrir o gel com um volume suficiente para coomassie azul e coloque sobre um roqueiro.
12. Rocha suavemente durante 1 hora à temperatura ambiente e decantar a mancha. Substituir a solução destain quando se torna azul escuro. Deter o gel durante a noite ou até que as bandas individuais são resolvidas no gel. Localizar duas bandas de colágeno (peso molecular = 90 kda e 130 kda) e observe a força das bandas contra os padrões e controles. A imagem do gel usando um sistema de gel doc, se necessário.

2. Isolamento e cultura de células do doador carcinoma mamário e fibroblastos de camundongos normais e PyVmT C57BL/6J

1. Idade sacrifício combinado feminino normal ou PyVmT camundongos transgênicos após 10 semanas de idade, quando os tumores são evidentes e palpáveis ​​na PyVmT camundongos transgênicos usando métodos aprovados IACUC.
2. Expor o mouse sobre as suas costas em uma superfície plana e imobilizar os membros usando fita adesiva.
3. Fazer uma incisão T de cabeça para baixo entre os mamilos da glândula mamária torácica e inguinal e puxe a retalho de pele para trás para expor as glândulas mamárias. Remover os tecidos mamários e mince em pedaços pequenos com uma tesoura cirúrgica.
4. Prepare 100 ml de um cocktail digestão enzimática contendo: 200 mg de tripsina, 500 mg de colagenase, 4 mg de DNAse, 100.000 unidades de hialuronidase em PBS estéril e antibióticos durante a noite no gelo e, em seguida, por 3 horas a 37 ° C.
5. Adicionar 10 ml de PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) para cada amostra ea célula centrífuga sedimento em uma centrífuga de bancada a 1500 rpm por 5 minutos a 4 ° C.
6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 5-7 ml de PBS/10% FBS. Repita o giro e lavar mais duas vezes.
7. Ressuspender o pellet celular em 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS contendo 50 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 50 mg / ml e 250 ng / ml anfotericina em 10 pratos centímetros revestidos com colágeno tipo I. Para placas de revestimento com colágeno, diluir o colágeno 1 ml (usando o estoque 1,5 mg / ml) em 39 ml de 0,02 N de ácido acético diluído em água destilada estéril ou PBS. Pipetar 5 ml de solução de trabalho de colágeno em 10 placas cm. Incubar a temperatura ambiente por um mínimo de 10 minutos. Aspirar colágeno em excesso. Placas Parafilm não utilizados e armazenar a 4 ° C por uma semana.
8. Troque a mídia 2-3 vezes por semana. Digestão dos tecidos de sucesso será caracterizada pela presença de focos epiteliais rodeado por células fibroblásticas fusiformes.
9. Separar os fibroblastos e células epiteliais por tryspinization seletivo. Aspirar a mídia e lavar as células com PBS uma vez. Ml 1 pipeta de 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA em células e incubar à temperatura ambiente. Fibroblastos são mais fracamente aderentes do que as células epiteliais. Verifique se há desprendimento de fibroblastos ao microscópio após 2 minutos, as células devem estar flutuando em suspensão ou arredondado, enquanto focos epiteliais ainda deve ser aderida à superfície.
10. Toque levemente o prato para soltar os fibroblastos e gentilmente pipeta 10 ml de meio contendo soro no prato para remover os fibroblastos.
11. Pipeta a mídia contendo fibroblastos em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar como descrito na etapa 5). Refaça essas células em colágeno revestido de 10 pratos cm e repita o processo seletivo até tripsinização fibroblastos e células epiteliais são completamente separados.
12. Verificar a pureza celular por imunofluorescência para os marcadores epiteliais como CK14 e CK18 e marcadores de fibroblastos como alfa actina de músculo liso (α-SMA).

3. Imunofluorescência de células cultivadas

1. Lugar lamínulas de vidro em 6 pratos cm. Esterilizar em exposição aos raios UV de 5 a 10 minutos em uma capela de fluxo laminar.
2. Brasão da lamela com ml 1-2 de solução de trabalho de colágeno estoque para 10 minutos em temperatura ambiente (RT). Aspirar o excesso.
3. Trypsinize e placa de 200 mil células epiteliais ou fibroblastos por amostra. Adicionar 3-5 ml de mídia completo e incubar por 24 horas.
4. Aspirar a mídia, lavar as células com PBS e fixar em metanol gelado a -20 ° C por 7 minutos.
5. Lavar as células com PBS duas vezes para remover o etanol, e bloquear com 1-2 ml de PBS contendo 1% de SFB por 1 hora em temperatura ambiente.
6. Utilizando uma pinça, remover as lamelas e coloque em um recipiente grande e rasa coberta com parafilme ou superfície hidrofóbica outros.
7. Diluir os anticorpos primários 1:100 em solução de bloqueio: anti-actina de músculo liso (α-SMA, anti-CK14 (marcador basal epitelial), anti-CK18 (marcador epitelial luminal).
8. Pipete 100 de anticorpos diretamente sobre as lamelas por 1 hora em temperatura ambiente. Incubar uma lamela separados das células em solução de bloqueio; esta amostra servirá de controle anticorpo secundário.
9. Aspirar anticorpos e pipeta de 1 ml de PBS diretamente sobre a lamínula de lavar. Aspirar e repetir 3-5 vezes.
10. Diluir os anticorpos secundários em solução de bloqueio: anti-mouse-alexa 488 a 1:100, mouse anti-biotinilado a 1: 500, anti-mouse-alexa-568.
11. Envolva o recipiente com as lamelas em papel alumínio. Pipetar 100 ul do anticorpo secundário apropriado diretamente sobre as lamelas: α-SMA com anti-mouse-alexa 568, CK 14 com coloração anti-rato biotinilado e CK18 com anti-mouse-alexa 488. Cubra o recipiente para proteger as amostras da luz visível.
12. Aspirar anticorpo e lavar com PBS como no passo 9). Deixar as amostras em PBS, com exceção de CK14 coloração.
13. Diluir estreptavidina conjugada com alexa 568 1:500 em PBS. Incubar as amostras coradas com CK14 strepatividin-alexa 568 por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. Lavar em PBS como no passo 9)
14. Diluir DAPI 1: 500 em PBS. Aspirar o PBS das amostras e incubar com DAPI por 10 minutos RT no escuro.
15. Enxágüe amostras com PBS. Pipete 100 de Prolong anti-fade reagente em lâminas de vidro, vire a lamínula de forma que as células estão enfrentando a lâmina de vidro. Incline a lamela a um ângulo para delicadamente fazer contato com a mídia de montagem.
16. Imagem as amostras usando um microscópio de imunofluorescência. Manter as amostras no escuro para proteger o sinal de imunofluorescência, que vai durar aproximadamente duas semanas.

4. Preparação das células de colágeno incorporados ao processo de enxertia

1. Para incorporar as células de colágeno, é necessário diminuir o pH do colágeno para obter através da mistura de polimerização do colágeno com uma solução de configuração. Preparar a solução de configuração através da mistura de 100 ml de Solução de Earl 10X de salina balanceada (EBSS) com 2,45 g de NaHCO3, 7,5 ml de NaOH 1 M e 42,5 ml de água destilada estéril. Além disso esterilizar usando uma garrafa de topo unidade micron 0,22 filtro ligado a uma garrafa estéril.
2. Misture o colágeno (concentração de ações 1 mg / ml) com ajuste de solução em um 4 de partida: uma relação. Para um enxerto, misture 100 ml de colágeno com 25 mL de solução de configuração em um tubo eppendorf. Brevemente vórtice ou pipeta na amostra cima e para baixo para misturar a amostra completamente.
3. Adicionar colágeno ou solução definição em incrementos de 50-10 mL e misture bem até que o corante vermelho de fenol nas mudanças mistura para uma luz rosa para cor de laranja, refletindo um pH neutro. A cor amarela indica pH ácido, enquanto rosa escuro reflete pH básico. Mantenha a mistura sobre o gelo para evitar a polimerização.
4. Remove os fibroblastos e células epiteliais da placa por tripsinização. Primeiro, aspire a mídia e lavar com 5 ml de PBS. Pipetar 1 ml de 0,25% trypsin/0.54 mM EDTA em HBSS por placa. Incubar em fibroblastos RT por 2-5 minutos. Incubar as células epiteliais a 37 º C por 2-6 minutos. Toque as placas de leve para retirar as células. Verifique se há desprendimento usando um microscope.Quench da tripsina por pipetagem 9 ml de meio completo no prato e transferência das células para um tubo estéril de 15 ml cônico.
5. Remover 50 ul e contagem de células por hemocitômetro. Observe o volume total de células em cada tubo (aproximadamente 10 ml).
6. Agregar as células a 1500 rpm por 5 min em temperatura ambiente. Aspirar o pellet celular e ressuspender as células a uma concentração de 100.000 mL cells/100. Por exemplo, ressuspender 500.000 células em um volume total de 500 mL de mídia completo.
7. Mix 250 mil células do estroma (250 mL) e 100.000 células tumorais (100 l) em um tubo separado. Microcentrífuga 10 seg rpm 1000, remova o sobrenadante por pipetagem. Adicionar 50 ul da solução de colágeno ajustada para as células. Pipeta cima e para baixo para dispersar as células uniformemente. Pipeta a 50 mL em uma chapa de seis centímetros estéreis de cultura de tecidos para formar uma gota circular. Incubar o enxerto, a 37 ° C por 10 minutos para polimerização.
8. Delicadamente adicionar 5 ml de meio completo no prato por prato a inclinação em um ângulo e, lentamente, pipetagem a mídia de um lado da placa. Incline a placa ao redor até que a mídia cobre o enxerto.
9. Incubar por 24 horas a 37 ° C. Transplante imediatamente.

5. Ortópticos transplante de células do colágeno incorporados em camundongos C57BL/6J

1. Fabricar um bastão de vidro fino para a cirurgia de transplante. Aqueça uma pipeta Pasteur de vidro usando um bico de Bunsen. Utilizando uma pinça, esticar o fim da pipeta para fora para 2-3 mm de espessura. Deixe esfriar, e esterilizar em etanol 70%.
2. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos seguir em autoclave e etanol 70%: multa tesoura cirúrgica, sem corte tesouras cirúrgicas, fórceps blunt, pinça fina, clips ferida, ferida de grampo
3. Anestesiar mouse usando com 2-3% isoflurano usando uma máquina de limpeza isoflurano. A média de vazão O ₂ utilizadas é de 1 L / minuto através do cone do nariz.
4. Lay o mouse sobre as suas costas e imobilizar os membros com fita ou adesivo removível outros. Remover os pêlos com removedor químico de cabelo, como Nair. Esterilizar o abdômen com algodão swabbing alternativa entre o etanol 70% e betadine de forma meta-like.
5. Realizar-se uma parte da pele pela glândula mamária usando uma pinça sem corte com uma mão. Com a outra mão, usando blunt tesoura cirúrgica para fazer uma cabeça para baixo T-incisão entre as 9 e # 10 mamilos ou # 4 e # 5 mamilos das glândulas mamárias inguinais para expor as glândulas mamárias.
6. Faça uma incisão de bolso sob o nó de linfa ou artéria mamária com pequenas tesouras cirúrgicas primavera.
7. Remover o enxerto de colágeno da placa de cultura de tecido usando uma pinça. Retire o excesso de líquido do enxerto de colágeno suavemente dabbing em um estéril limpe e deslize o enxerto de colágeno completamente no bolso usando um bastão de vidro fino.
8. Sutura do retalho de pele usando suturas # 2 gut absorvíveis ou grampos ferida.
9. Vamos recuperar o rato na gaiola.
10. Monitorar os ratos duas vezes por semana no mínimo, palpação de tumores. Sacrifício dos camundongos, quando os tumores atingem um centímetro de diâmetro. Tecidos colheita para análise.

6. Resultados representativos:

Isolamento e extração de colágeno de camundongos C57BL/6J

Estes procedimentos foram adaptados a partir de ^1. Extração de proteínas de colágeno da cauda do rato 07/05 rende aproximadamente 1-1,5 mg / ml em um volume de 6 ml final, ou 6-9 mg de proteína. Por coommassie mancha, bandas correspondentes a 90 e 130 kda kda são detectados nas pistas carregado com amostras extraídas da cauda do rato, indicando a presença de colágeno tipo I e pró-colágeno, respectivamente (Figura 1).

Isolamento e cultura de células de carcinoma mamário e fibroblastos de camundongos normais e PyVmT C57BL/6J.

Os procedimentos foram adaptados de ^2. Células de carcinoma PyVmT e fibroblastos podem ser distinguidos por diferenças na morfologia celular e expressão de determinados mar epiteliais e mesenquimaiskers. Células de carcinoma PyVmT são identificados pela forma de paralelepípedos e co-expressam CK18, um marcador epitelial e luminal CK14, um marcador basal epitelial, mas não expressar α-SMA (Figura 2). Fibroblastos são células mamárias maiores, com um fenótipo fusiformes e expressam altos níveis de α-SMA, mas não expressam CK14 ou CK 18 (Figura 2). Estes dados indicam mais de 95% para a pureza de células fibroblastos e células epiteliais usando os procedimentos descritos.

Ortópticos transplante de células do colágeno incorporados em camundongos C57BL/6J

Estes procedimentos foram adaptados de ^{3, 4.} Camundongos transplante destinatário são sacrificados quando os tumores em cada grupo experimental atingir 1,0 cm de diâmetro, ou cerca de 60 dias. Enquanto o transplante de células PyVmT sozinha resultados em tumores palpáveis, após 30-40 dias, chegando a uma massa de tumor significa 0,335 gramas em 60 dias, a co-transplante de células de carcinoma mamário PyVmT com resultados fibroblastos em um médio de massa tumoral de 0,630 gramas, indicando aumento do crescimento tumoral por fibroblastos (Figura 3).

Figura 1. Coomassie análise mancha de colágeno tipo I extração da cauda de rato. BSA (~ 66 kDa) é indicado por uma seta. Colágeno de cauda de ratos comercial (20 mg de proteína), e cauda de colágeno purificado rato (20 mg de proteína) são indicados por caixa (~ 130 kDa, ~ 90 kda proteínas). Std = standard peso molecular.

Figura 2. Imunofluorescência de células de doadores PyVmT carcinoma mamário e fibroblastos. Painéis a e b representam PyVmT células de carcinoma mamário histoquímica para os anticorpos para CK14 e CK18. Painel c representa fibroblastos corados com anticorpos para α-SMA. As imagens mostradas com DAPI sobreposição com ampliação de 20x.

Figura 3. Desenvolvimento de tumores mamários em ratos C57BL/6J na presença ou ausência de fibroblastos. Tumores mamários foram colhidas de camundongos transplantados com células de carcinoma PyVmT na presença ou ausência de fibroblastos mamárias e pesado. Média + erro padrão da média. N = 6 por grupo.

Discussão

A contribuição funcional de fibroblastos na progressão tumoral tem sido demonstrado através de modelos de transplantes, em que os fibroblastos carcinoma associados co-transplantados com resultados benignos mamários células epiteliais no crescimento do tumor aumentou e invasão ^5. Abordagens transplante convencional envolveram o uso de camundongos SCID ou nuas para co-transplante de células do estroma e do epitélio de diferentes origens genéticas do rato ou de espécies diferentes. Ratinhos imunocompr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Camundongos C57BL/6N	Harlan	N / A
MMTV-PyVmT camundongos transgênicos	Jackson laboratórios	002374
Soro fetal bovino	Pescador	SH3039603PR
DMEM	VWR	10000113873
Penicilina / estreptomicina	Pescador	MT-30-001
anfotericina	pescador	BP2645-20
Filtração Amicon colunas ultracel 50k	Millipore	UFC905008
Tubos para rotor Beckman TI	Beckman	355618
Colágeno da cauda de rato	Pescador	CB 40.236
EBSS 10x	Sigma Aldrich	E7510-100ML
Tripsina 1X, 0,25% em HBSS cálcio w / o e Magnésio	Pescador	MT-25-050-CI
Ácido acético glacial	Pescador	A491-212
Coomasie azul	Pescador	BP101 25
Tripsina	Sigma Aldrich	T3924-100 ml
A colagenase	Sigma AldrichC0130-50
hyalronidase	Sigma Aldrich	H3884
DNase	Sigma Aldrich	D5025
Padrão de proteínas caleidoscópio	Biorad	1610375
Lâminas de vidro	Pescador	12545-78
Lamínulas de vidro	VWR	101400-042
Vimentina anticorpo S-20	Santa Cruz Biotechnology	SC-7558
α-actina de músculo liso de anticorpos	Abcam	ab5694
Anticorpo CK14	Santa Cruz Biotechnology	sc-53253
Anticorpo CK18	Abcam	ab668
DAPI	Sigma Aldrich	D9542
Anti-rato biotinilado	Vector laboratórios	BA9200	Distribuídos através de Fisher
Anti-mouse-alexa-568	Invitrogen	A10037
Anti-mouse-alexa-488	Invitrogen	A11001
Estreptavidina-alexa-488	Invitrogen	S11226
DAPI	Invitrogen	D21490
Prolongar Antifade	Invitrogen	P-36930
Tesoura cirúrgica	Multa Ferramentas Ciência	91400-12
Multa tesoura primavera	Multa Ferramentas Ciência	15000-02
Blunt forceps	Multa Ferramentas Ciência	11002-12
# 5 pinça fina	Multa Ferramentas Ciência	11251-10
Sutura crômico Gut	Pescador	NC9326254
Pipeta Pasteur de vidro	Pescador	22-042-815
Etanol	Pescador	A406P 4
betadine	pescador	NC9386574
Grampos de sutura	Pescador	12032-07
Grampo ferida	Pescador	12031-07