Ensayo de adherencia de frecuencia para In Situ El análisis de la cinética de unión de la Cruz-Las interacciones moleculares en la interfaz célula-célula

Resumen

Un ensayo para medir la frecuencia de adhesión ligando del receptor de la cinética de interacción cuando ambas moléculas están anclados en la superficie de las células que interactúan se describe. Este ensayo mecánico basado en se ejemplifica mediante la micropipeta presurizado glóbulo rojo humano como sensor de adhesión y αLβ2 integrina y la molécula de adhesión intercelular-1 como interactúan los receptores y ligandos.

Resumen

El ensayo de adhesión micropipeta fue desarrollado en 1998 para medir dos dimensiones (2D) ligando del receptor de la cinética de unión ^1. El ensayo utiliza un glóbulo rojo humano (RBC) como sensor de la adhesión y la célula presentadora de una de las moléculas que interactúan. Emplea a micromanipulación para que la RBC en contacto con otra célula que expresa la molécula interactúa con otras área controlada con precisión y el tiempo para permitir la formación de enlaces. El acto de adhesión se detecta como la elongación de glóbulos rojos a tirar de las dos células separadas. Mediante el control de la densidad de los ligandos inmovilizados en la superficie de glóbulos rojos, la probabilidad de que la adhesión se mantiene en el rango medio entre 0 y 1. La probabilidad de adherencia se estima a partir de la frecuencia de los fenómenos de adhesión en una secuencia de ciclos repetidos contactos entre las dos células de un tiempo de contacto determinado. Variando el tiempo de contacto genera una curva de unión. Ajuste de un modelo probabilístico para la reacción del receptor-ligando ^una cinética de la unióncurva de rendimientos de la afinidad en 2D y descuento sobre la tarifa.

El ensayo ha sido validado con las interacciones de los receptores Fc gamma con IgG Fc ^1-6, selectinas con ligandos glicoconjugados ^6-9, las integrinas con ligandos ^10-13, homotypical vinculante cadherina ^14, receptor de células T y co-receptor con complejos de histocompatibilidad péptido principales ^{15 - 19.}

El método se ha utilizado para cuantificar las regulaciones de la cinética en 2D, los factores biofísicos, tales como la membrana microtopology ^5, la membrana de anclaje ^2, la orientación molecular y longitud ^6, rigidez portador ^9, la curvatura de ^20, y la fuerza de compresión ^20, así como los factores bioquímicos, como moduladores del microambiente del citoesqueleto y la membrana donde las moléculas interactúan y viven de la organización superficie de estas moléculas ^15,17,19.

El método también se ha utilizado to estudiar la unión simultánea de dos ligando del receptor de la misma especie ^3,4, y las interacciones trimolecular ¹⁹ utilizando un modelo modificado ^21.

La principal ventaja del método es que permite el estudio de los receptores de membrana en su ambiente nativo. Los resultados podrían ser muy diferentes de los obtenidos con receptores purificada ^17. También permite el estudio de las interacciones ligando-receptor en un plazo de tiempo inferiores a un segundo con una resolución temporal más allá de los métodos bioquímicos típicos.

Para ilustrar el método de adherencia micropipeta frecuencia, se muestra la medición cinética de la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) en los glóbulos rojos funcionalizados la unión a la integrina α β _{2 L} de neutrófilos con dimérica E-selectina en la solución para activar α β _{L 2.}

Protocolo

1. Los glóbulos rojos aislados de la sangre entera

1. Prepare EAS-45 soluciones. Sopesar todos los ingredientes de la Tabla I y se disuelven en 100-200ml de agua DI. Agregar agua hasta 1000 ml solución y ajustar el pH a 8.0. Filtro y alícuotas de 50 ml. Congelar a -20 ° C para su almacenamiento.

Nota: El paso 1.2 debe ser realizada por un técnico profesional de la medicina como una enfermera, con una Junta de Revisión Institucional protocolo aprobado.

2. Dibuja 3 de 5 ml de sangre de la vena cubital mediana en un tubo de 10 ml que contiene EDTA y mezcle suavemente la sangre con EDTA inmediatamente ya fondo para evitar la coagulación.
3. Proceso de muestra de sangre tan pronto como sea posible. Todos los pasos siguientes, excepto la centrifugación se debe hacer bajo el capó para mantener la preparación estéril. Transferencia de la sangre a un tubo de centrífuga de 50 ml, agregar 10 ml de Histopaque frío y estéril 1077 y centrifugar durante 5 min @ 1000 rpm, 4 º C. Repita dos veces.
4. Añadir 10ml fría y estéril PBS, durante 5 minutos @ 1000 rpm, 4 º C. Eliminar el sobrenadante. Repite 4 veces (un total de 5 veces).
5. Lavar con agua estéril EAS-45 (5 min @ 1000 rpm, 4 ° C) dos veces. Durante los últimos glóbulos rojos se mueven de lavado a un nuevo tubo de 15 ml estéril.
6. Resuspender los eritrocitos in10ml EAS-45.

2. Los glóbulos rojos biotinilación

1. Tome el tubo con los glóbulos rojos en el paso 1. Eliminar todas las sobrenadante tras centrifugación durante 5 min @ 1000 rpm, 4 º C. Ponga 10μl de los glóbulos rojos de pellets a cada uno de varios viales y agregue la cantidad correspondiente de PBS a cada vial (ver Tabla II, por ejemplo, de la preparación de seis concentraciones diferentes biotinilación glóbulos rojos).
2. Hacer nuevas Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluciones de acuerdo a la Tabla II.
3. Añadir 10μl de tampón borato 0,1 M a cada vial.
4. Agregue la cantidad calculada de la solución de biotina a cada vial (ver Tabla II como ejemplo) y agitar inmediatamente.
5. Coloque cada vial RBCdentro de un tubo cónico de 50 ml y se incuba durante 30 minutos en rotador a temperatura ambiente.
6. Lavar el vial 3 veces con 800μl de EAS-45 @ 2000 rpm durante 2 minutos.
7. Agregar 100μl de EAS-45 a cada vial y almacenar a 4 ° C. En cada 1μl de la solución final debería ser ahora ~ 1mln de los glóbulos rojos.

3. Funcionalización de la * biotina ligada a ligandos en los glóbulos rojos

1. Prepare una solución de estreptavidina 2mg/ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aliqouted solución puede conservarse a -20 ° C.
2. Mezcle la misma cantidad de glóbulos rojos en el paso 2.7 (10μl) con una solución de estreptavidina, vortex e incubar inmediatamente en el rotador de 30 minutos a 4 ° C.
3. Lavar 3 veces con 500μl de EAS-45 @ 2000 rpm durante 2 minutos. Añadir 15μl EAS-45 / 1% de BSA para el almacenamiento.
4. Mezcle la misma cantidad de glóbulos rojos en el paso 3.3 (10μl) con una solución de ligando 20μg/ml, vortex e incubar inmediatamente en el rotador de 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Lavar dos veces con 500μl de EAS-45 / 1% BSA durante 2 minutos @ 2000rpm. Añadir 15μl de EAS-45 / 1% de BSA para el almacenamiento.

* Si la proteína no tiene ningún vínculo con biotina puede utilizar uno de los kits disponibles en el mercado de biotinilación de proteínas (por ejemplo, Thermo Scientific 21955 # EZ-Link Micro-NHS-peg4 biotinilación Kit) o ​​el uso de anticuerpos con biotina captura como un paso intermedio, como se muestra en el video.

4. La cuantificación de la densidad de receptores y ligandos

1. Incubar ligando recubierto de glóbulos rojos en el paso 3 y, en otro vial, teniendo los receptores de las células con concentraciones de saturación de mAbs respectivos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Incubar en las células de viales separados de irrelevante isotipo de anticuerpos para el control. Si los anticuerpos primarios no están marcados con fluorescencia, se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
2. Analizar las muestras preparadas en el paso 4.1 por cytometery flujo con sus correspondientes cal fluorescentesibration cuentas. Calcular las densidades, como se muestra en la fig. 1.

5. Preparación para la micropipeta y la cámara de celular

1. Tire de micropipetas de tubos capilares con PN-30 Extractor magnético Narishige 'microelectrodos de vidrio horizontal o Sutter Micropipeta Instrumentos de extractores.
2. Use micromanipulador con microforge para ajustar la punta de la micropipeta tiró al tamaño deseado (por lo general los rangos de diámetro requerido de 1-5μm según el tamaño de las células para ser utilizadas en el estudio).
3. Prepare la cámara de la célula mediante la reducción de la cubierta de vidrio para microscopio con el tamaño deseado. Sellar la cámara utilizando el aceite mineral de ambas partes para evitar la evaporación del medio para cambiar la osmolaridad durante el experimento.
4. Añadir las células del receptor-ligando y teniendo a la cámara.

6. Adherencia micropipeta frecuencia de ensayo

1. Aspirar las células interactuando por pipetas respectivos y el uso de computadoras programadas piezoelectr Traductor IC para conducir los glóbulos rojos dentro y fuera de contacto con la célula con otra área de contacto controlado y tiempo. Detectar eventos de adhesión mediante la observación de la elongación de glóbulos rojos en caso de separación de células.
2. Repita el ciclo de contacto-retracción 50-100 veces por un tiempo de contacto determinado. Registrar los eventos observados adhesión mediante la adición de "1" para la adhesión o "0" para no adherencia en una columna de hoja de cálculo Excel. Usted puede usar un dispositivo de grabación, por ejemplo, medios digitales o de video, las imágenes microscópicas.
3. Registro de la frecuencia de adherencia en relación con la curva de tiempo de contacto con al menos tres pares de células diferentes para cada tiempo de contacto para obtener una media y SEM.
4. Registro de la curva de unión no específica para el control mediante el uso de los glóbulos rojos recubiertos con ligandos irrelevantes (por ejemplo, BSA) y / o el bloqueo de los ligandos o receptores con sus AcMo específicos bloqueo funcional. Frecuencia de adhesión específicas en cada punto de tiempo de contacto se puede calcular mediante la eliminación de la frecuencia de adherencia no específica ^1.

ove_title "> 7. Análisis de datos

1. Ajustar la frecuencia de adhesión específicas P _a los datos de contacto en comparación con el tiempo t por un modelo probabilístico (Ecuación 1) que describe una segunda orden de avance y de primer orden inverso, de un solo paso la interacción entre una especie y de los receptores de una sola especie de ligandos ¹ :
   
   donde K es _una afinidad de unión del 2D efectiva, k es el _de fuera de ritmo, m _r e _l m son los receptores respectivos y la densidad de ligando medido en el paso 4, y A _c es el área de contacto. La curva de ajuste tiene dos parámetros, A _c K _a y _de k, como una _C y _una K se agrupan y llamados colectivamente como la afinidad 2D eficaz. Su producto con el off-rate es la efectiva 2D en clase: A _c = k _en A _c K _a K x _fuera.
   La adhesión de frecuencia específica P _a se calcula mediante la resta de la fracción de la adhesión no específica (P _{inespecífica)} a partir de la adhesión total medido (P _medido) ^1,21:
   

8. Los resultados representativos:

Figura 1 Determinación de la integrina α β _{L 2} densidad de sitios en los neutrófilos. Los neutrófilos se incubaron primero con 1μg/ml de E-selectina-Ig de 10 minutos para que coincida con las condiciones experimentales utilizadas en las figuras 3,4 o sin la E-selectina-Ig, y luego, con concentraciones de saturación (10μg/ml) de PE-conjugado anti -CD11a humanos MAB (clon HI111, consulte la Tabla de determinadosreactivos y equipos) o ratón IgG1 irrelevante para el control, se lavan, y se analizó inmediatamente. Las muestras fueron leídas en el citómetro de flujo BD LSR con el estándar de bolas de calibración QuantiBRITE PE. El panel A muestra los histogramas de fluorescencia de bolas de calibración (rosa), junto con los de E-selectina-Ig células tratadas (color azul) o sin tratamiento (color verde). Específicas CD11a tinción AcM se muestra en las curvas sólidas e irrelevante tinción isotipo del anticuerpo de control se muestra en las curvas de puntos. Las células tratadas con E-selectina-Ig (presencia en todas las etapas de lavado y en tampón FACS) no afectó la densidad de CD11a como se ve desde la comparación con las células no tratadas. El panel B muestra el proceso de cuantificación de la densidad. Log10 se ha calculado para la media de intensidad de fluorescencia (FI) de cada valor máximo de cuatro bolas de calibración de los histogramas de Grupo A (círculos de color rosa) y por la gran cantidad de moléculas específicas-PE por bolas (del fabricante). Una regresión lineal de moléculas de Log10 PE por bolas contra Log10 fluoresccia se trazó. Por E-selectina células tratadas la Log10 FI (y) los valores de la igualdad de 3,99 (círculo de color azul) y 2,23 (círculo azul abierto) para el AcMo específico y el anticuerpo control, respectivly. Hemos resuelto la ecuación lineal de x (los valores se representan como círculos de color verde y azul en el panel B) x = Log10 PE / celular y, como PE:. AcM relación fue de 1:1, el número total de α β _{2 L} de neutrófilos fue calcula como 9587. Densidad de la superficie se calculó en 43 moléculas / m ^2, con 8.4μm como el diámetro de neutrófilos ^22. Densidad de ICAM-1 se midió de manera similar por cytometery de flujo utilizando PE-anti-CD54 humano MAB, lo que equivalía a 65 mol / m ^2.

Figura 2 Micropipeta los diagramas del sistema. Nuestro sistema de micropipeta se reunió en la casa y se compone de tres subsistemas: el subsistema de formación de imágenes para permitir que uno observa, record y analizar los movimientos de la célula micropipeta de aspiración, un subsistema de micromanipulación para permitir una para seleccionar las celdas de la cámara de celular, y un subsistema de la presión para permitir que uno de aspirar las células en las micropipetas. La pieza central del subsistema de imagen tiene su microscopio invertido (Olympus IMT-2 IMT2), con una inmersión en aceite de 100x objetivo 1,25 NA. La imagen se envía a una grabadora de vídeo a través de un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD). Un contador de tiempo de video se acopla al sistema para mantener la noción del tiempo. Cada micropipeta puede ser manipulado por un accionamiento mecánico montado en el microscopio y finalmente coloca con un micromanipulador hidráulico de tres ejes. Manipuladores mecánicos de Newport podría ser utilizado también. Uno de los titulares de micropipeta se monta en un traductor piezoeléctrico, el conductor de la cual es controlada por un código de computadora LabView (bajo petición) y la traduce en señales a través de una tarjeta DAQ a través de un amplificador de voltaje (en casa) en el actuador piezoeléctrico. Este es unllows uno para mover la pipeta de precisión y repetible en un ciclo de prueba de adhesión. El subsistema de regulación de presión se utiliza para el control de aspiración durante el experimento. Una tubería hidráulica se conecta el titular micropipeta a un depósito de líquido. Un posicionador de mecánica fina permite que la altura del embalse que precisamente manipulada.

Micropipetas se generan con Kimax punto de fusión tubos de vidrio de borosilicato capilar (con diámetro exterior de 1,0 ± 0,07 mm y un diámetro interior de 0,7 ± 0,07 mm. En primer lugar, las micropipetas de tubos capilares se extraen utilizando PN-30 Extractor magnético Narishige 'microelectrodos de vidrio Horizontal (Sutter Instrumentos Micropipeta Extractor es otra opción de asistente de cámara). Segundo sistema, Microforge (construido en la casa) se utiliza para cortar las micropipetas para la apertura de tamaño deseado. Los modelos comerciales de los sistemas de Microforge están disponibles también.

Para evitar la vibración de las micropipetas durante el experimento, el microscope, junto con el micromanipulador, se coloca en una mesa de suspensión de aire.

Figura 3 Ejecución F adhesión frecuencia _i específicos (A) e inespecíficos (B) que se une a 1s (rojo) y 10 (azul) mide los tiempos de contacto de los ciclos repetidos de adhesión de prueba entre los glóbulos rojos recubiertos con ICAM-1 (A) o Higg (B ) con los neutrófilos humanos que expresan la integrina α β _{L 2.} F _i = (X ₁ + X ₂ + ... + X _i) / i (1 ≤ i ≤ n), donde i es el índice del ciclo de prueba, X _{i es} igual a "1" (adherencia) o "0" (no adherencia). F _n (n = 50) fue utilizado como la mejor estimación de la probabilidad de adherencia.

Figura 4 Cinética deICAM-1 a la integrina α β neutrófilos _{L 2} ( ). Probabilidad de adherencia medido como se muestra en la Figura 3 para tres pares de células en cada tiempo de contacto promedio es y representa frente al tiempo de contacto. El medio de la cámara se HBSS con 1 mM de cada uno de Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +,} además de 1μg/ml dimérica E-selectina-Ig para regular al alza β α _{L 2} vinculante. Para la captura de ICAM-1-Ig en los glóbulos rojos, un paso intermedio se añadió para la incubación de los glóbulos rojos con anticuerpos de captura 10μg/ml (biotinilado de cabra anti-Fc de anticuerpos humanos, eBioscience) después de la etapa de incubación estreptavidina. Para controlar la unión inespecífica dos condiciones se utilizaron diferentes: 1) los glóbulos rojos recubiertos con el anticuerpo de captura anti-humano-Fc y se incubaron con IgG humana en lugar de ICAM-1-Ig (O) y 2) los neutrófilos unión a los glóbulos rojos no cubiertas con la captura de anticuerpos (Δ). 10μg/ml IgG humana fue introducido en el medio para minimizar la unión de la E-Selectina-Ig en la solución a la captura de anticuerpos en la superficie de glóbulos rojos. La unión no específica registrada como la IgG humana curva de control se utilizó para obtener una curva de adherencia probabilidad específica (en ) Usando la ecuación. 2. Montaje de adhesión específicas curva de probabilidad con la ecuación. 1 (línea continua) volvió afinidad de unión efectiva una K _{c a} = 1,4 • 10 ^-4 μm4 y k _off = 0.3 s ^-1.

Reactivo	MW (g / mol)	Concentración (mM)	Cantidad (g)
Adenina	135.13	2	0.27
D-glucosa (dextrosa)	180.16	110	19.82
D-Manitol	182.17	55	10.02
Cloruro de sodio (NaCl)	58.44	50	2.92
El fosfato de sodio, dibásico (Na HPO )	141.95	20	2.84
L-glutamina	146.15	10	1.46

Tabla 1. Preparación EAS-45 buffer (1L).

25 mg de biotina-XHS en 550 l de DMF	0,1 M biotina solución
Dilución de 1:10 de la biotina 0,1 w / DMF	0,01 M biotina solución
Dilución 1:100 de 0,1 biotina w / DMF	0,001 M biotina solución

Tabla 2. Preparación de la solución de biotina.

biotina concentración final (M)	4	10	20	50	100	160
Los glóbulos rojos de pellets de valores (l)	10	10	10	10	10	10
1x PBS (l)	179,2	178	176	179	178	176,8
0,1 M tampón de borato (l)	10	10	10	10	10	10
0,01 M biotina solución (l)				1	2	3.2
0,001 M biotina solución (l)	0.8	2	4

Tabla 3. Biotinilación de los glóbulos rojos.

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Discusión

Para utilizar con éxito la adhesión micropipeta ensayo de frecuencia se deben considerar varios pasos críticos. En primer lugar, asegúrese de registrar la interacción específica para el sistema de receptor-ligando de interés. Medidas no específicas de control (ver fig. 3, 4) garantizar la especificidad. Idealmente, las probabilidades no específicos de adhesión debe ser inferior a 0,05 para todas las duraciones de tiempo de contacto y tener una diferencia significativa entre las probabilidades de adhesión espe...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Catálogo #	Comentarios
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Diluir a 1X con agua desionizada antes de su uso
Vacutainer con EDTA	BD	366643	Los glóbulos rojos de aislamiento
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Los glóbulos rojos de aislamiento
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 preparación
D-glucosa (dextrosa)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 preparación
D-Manitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 preparación
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 preparación
El fosfato de sodio, dibásico (Na & # x2082; HPO ₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 preparación
L-glutamina	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 preparación
Biotina-X-NHS	Calbiochem	203188	Los glóbulos rojos biotinilación
Dimetilformamida (DMF)	Thermo Scientific	20673	Los glóbulos rojos biotinilación
Tampón de borato (0,1 M)	Microscopía electrónica de Ciencias	11455-90	Los glóbulos rojos biotinilación
Estreptavidina	Thermo Scientific	21125	Ligando funcionalización
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligando funcionalización
Quantibrite PE Cuentas	BD Biosciences	340495	Densidad de cuantificación
Citómetro de flujo	BD Immunocytometry Sistemas	BD LSR II	Densidad quancación
Tubo Capilar 0.7-1.0mm x 30 "	Kimble Glass Inc.	46485-1	Micropipeta tirando
Aceite mineral	Fisher Scientific	BP2629-1	Cámara de la Asamblea
Tapa de vidrio para microscopio	Fisher Scientific	12 a 544-G	Cámara de la Asamblea
PE-α humana CD11a Clon HI 111	eBioscience	12-0119-71	Reactivo para la figura 1
PE anti-CD54 humano	eBioscience	12-0549	Reactivo para la figura 1
Mouse IgG1 control de isotipo PE	eBioscience	12-4714	Reactivo para la figura 1
micromanipulador hidráulico	Narishige	MO-303	Micropipeta sistema
Manipulador mecánico	Newport	461-xyz-M, SM-13, DM-13	Micropipeta sistema
traductor piezoeléctrico	Physik Instrumente	P-840	Micropipeta sistema
LabVIEW	National Instruments	La versión 8.6	Micropipeta sistema
DAQ	National Instruments	USB-6008	Micropipeta sistema
Mesa óptica	Cinética de los sistemas de	5200 Series	Micropipeta sistema