Адгезия частот для пробирной В Ситу Кинетика Анализ кросс-соединительного молекулярных взаимодействий в клетка-клетка интерфейс

Резюме

Анализ сцепления частоты для измерения рецептор-лиганд кинетики взаимодействия, когда обе молекулы закреплены на поверхностях взаимодействующих элементов описан. Это механически основе анализа является примером использования микропипетки под давлением человеческого эритроцита, как адгезия датчика и интегрина αLβ2 и межклеточной молекулы адгезии-1 в качестве взаимодействующих рецепторов и лигандов.

Аннотация

Анализ микропипетки адгезии была разработана в 1998 году для измерения двумерной (2D) рецептор-лиганд кинетики ^1. Анализ использования человеческих красных кровяных телец (эритроцитов) в качестве датчика сцепления и представления ячейки для одного из взаимодействующих молекул. В нем занято микроманипуляция принести РБК в контакт с другой ячейке, что выражает другой молекулы, взаимодействующие с точно контролируемой зоне и время для включения образования связей. Адгезии событие определяется как относительное удлинение на РБК тянет две ячейки друг от друга. Контролируя плотность лигандов, иммобилизованных на поверхности эритроцитов, вероятность адгезии находится в середине диапазона между 0 и 1. Адгезии вероятность оценивается по частоте адгезии события в последовательности циклов повторный контакт между двумя ячейками для данного времени контакта. Варьируя время контакта создает обязательную кривой. Установка вероятностную модель для рецептор-лиганд кинетику реакции с ¹ по обязательнымкривая возвращает 2D близости и вне курса.

Анализа была подтверждена использованием взаимодействия Fcγ рецепторов IgG Fc ^1-6, селектины с гликоконъюгата лигандов ^6-9, интегрины с лигандами ^10-13, homotypical кадгерина обязательной ^14, Т-клеточного рецептора и coreceptor с пептида-майор гистосовместимости комплексов ^{15 - 19.}

Метод был использован для количественного правила 2D кинетики биофизических факторов, таких как мембраны microtopology ^5, мембранного якоря ^2, молекулярной ориентации и длины ^6, перевозчик жесткость ^9, кривизна ^20, и удар силой ^20, а также биохимических факторов, такие как модуляторов цитоскелета и мембраны микросреды, где проживают взаимодействующих молекул и поверхности организации этих молекул ^15,17,19.

Метод также используется то изучение одновременного связывания двойной рецептор-лиганд видов ^3,4 и тримолекулярных взаимодействия ^{19 с} использованием модифицированной модели ^21.

Главным преимуществом метода является то, что она позволяет изучение рецепторов в их родной среде мембраны. Результаты могут существенно отличаться от тех, полученные с использованием очищенных рецепторов ^17. Она также позволяет изучение рецептор-лиганд в доли секунды сроки с временным разрешением далеко за рамки типичных биохимических методов.

Для иллюстрации частоты микропипетки адгезии методом, мы показываем кинетики измерения межклеточные молекулы адгезии 1 (ICAM-1) функционализированных на эритроциты привязки к интегрина α _L β ₂ на нейтрофилы с димерных E-селектина в растворе для активации α _L β _2.

протокол

1. Эритроциты изоляции от цельной крови

1. Подготовка EAS-45 решений. Взвесьте все ингредиенты из таблицы, и растворите в 100-200мл воды DI. Добавить воды, чтобы сделать 1000 мл раствора и регулировать рН до 8,0. Фильтр и аликвоты по 50 мл. Замораживание при -20 ° С для хранения.

Примечание: Шаг 1.2 должна проводиться квалифицированным медицинским работником, таких как медсестры, с институциональной наблюдательного совета утвержденным протоколом.

2. Нарисуйте 3-5 мл крови из локтевой вены среднего в 10 мл пробирку, содержащую ЭДТА и осторожно смешать кровь с ЭДТА немедленно и тщательно, чтобы избежать образования тромбов.
3. Процесс образец крови как можно скорее. Все следующие шаги, кроме центрифугированием должно быть сделано под капотом, чтобы держать подготовки стерильной. Передача крови 50 мл центрифужную пробирку, добавьте 10 мл холодной и стерильной Histopaque 1077 и центрифуга для 5мин @ 1000rpm, 4 ° C. Повторите дважды.
4. Добавить 10мл холодной и стерильной PBS, центрифуга для 5мин @ 1000rpm, 4 ° C. Удалить супернатант. Повторить 4 раза (всего 5 раз).
5. Промыть стерильной EAS-45 (5 мин @ 1000rpm, 4 ° С) в два раза. За последние стиральной двигаться эритроцитов в новую стерильную 15 мл пробирку.
6. Ресуспендируют эритроцитов in10ml EAS-45.

2. Эритроциты биотинилирование

1. Возьмите трубку с эритроцитов, начиная с шага 1. Удалите все супернатант после центрифугирования для 5мин @ 1000rpm, 4 ° C. Поместите 10 мкл эритроцитов гранул для каждого из нескольких флаконов и добавить соответствующее количество PBS в каждом флаконе (см. табл например подготовки шести различных биотинилирование эритроцитов концентрации).
2. Сделайте свежие Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 разведения в соответствии с табл.
3. Добавить 10 мкл буфера 0,1 М бората для каждого флакона.
4. Добавить расчетное количество биотина решение каждого флакона (см. таблицу II в качестве примера) и вихревой немедленно.
5. Место каждого флакона РБКв 50 мл коническую трубку и инкубировать на поворотное устройство в течение 30 минут при комнатной температуре.
6. Вымойте каждого флакона 3 раза 800μl ШАЛ-45 для 2min @ 2000rpm.
7. Добавить 100 мкл EAS-45 для каждого флакона и хранить при температуре 4 ° C. В каждом из 1 мкл окончательное решение теперь должно быть ~ 1 млн. эритроцитов.

3. Функционализация биотин связанных лигандов * на эритроциты

1. Подготовка 2mg/ml стрептавидин решение в соответствии с инструкциями производителя. Aliqouted решение может храниться при температуре -20 ° C.
2. Смешайте равное количество эритроцитов, начиная с шага 2.7 (10 мкл) с стрептавидином решение, вихревые немедленно и инкубировать на ротатор в течение 30 минут при 4 ° C.
3. Промыть 3 раза с 500 мкл ШАЛ-45 для 2min @ 2000rpm. Добавить 15μl EAS-45 / 1% BSA для хранения.
4. Смешайте равное количество эритроцитов, начиная с шага 3.3 (10 мкл) с 20μg/ml решение лиганд, вихревые немедленно и инкубировать на ротатор в течение 30 минут при комнатной температуре.
5. Мыть два раза с 500 мкл ШАЛ-45 / 1% BSA за 2 минуты @ 2000rpm. Добавить 15μl ШАЛ-45 / 1% BSA для хранения.

* Если ваш белок не имеет биотин ссылке вы можете воспользоваться одним из имеющихся в продаже наборов для белка биотинилирование (например, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-биотинилирование Kit) или использовать биотинилированного захвата антител в качестве промежуточного шага, как показано в видео.

4. Количественная оценка рецептор и лиганд плотности

1. Инкубируйте лиганд-покрытием эритроцитов, начиная с шага 3, и в различных флаконе, несущих рецептор клеток с насыщающей концентрации соответствующих моноклональных антител в течение 30 минут при комнатной температуре. Инкубируйте в отдельных камерах флаконов с неуместной изотипа соответствием антител для контроля. Если первичные антитела не флуоресцентно меченных, инкубировать с флуоресцентно-сопряженных вторичными антителами в соответствии с инструкциями производителя.
2. Анализ образцов, полученных в шаге 4,1 потоком cytometery с соответствующими флуоресцентными калibration бисером. Рассчитайте плотности, как показано на рис. 1.

5. Подготовка к микропипетки и клеточной камере

1. Потяните микропипетки из капилляров использования PN-30 Магнитные Narishige "Стекло Микроэлектродные Горизонтальное Puller или Саттер инструменты микропипетки Puller.
2. Использование микроманипулятора с microforge настроить кончик потянул микропипетки до нужного размера (как правило, требуется диапазонов диаметром от 1-5 мкм в зависимости от размера ячейки, которые будут использованы в исследовании).
3. Подготовка ячейки камеры резки стекла микроскопа Обложка до нужного размера. Уплотнение камеры использовании минерального масла с обеих сторон, чтобы избежать испарения средний изменить осмолярность в ходе эксперимента.
4. Добавить рецептор-лиганд и несущих клеткам камеры.

6. Микропипетки адгезии частоты анализа

1. Аспирируйте взаимодействующих клеток соответствующих пипетки и использовать компьютер запрограммирован piezoelectr IC переводчик ездить РБК и выходить из контакта с другой ячейке с контролируемой зоне контакта и время. Определение сцепления событий, наблюдая РБК удлинение при клетка разделения.
2. Повторите контакт-ретракция цикла 50-100 раз для данного времени контакта. Запись наблюдаемых явлений адгезии путем добавления "1" для адгезии или "0" не адгезии в столбце таблицы Excel. Вы можете использовать устройство записи, например, цифровых средств массовой информации или видеозаписи, для микроскопических изображений.
3. Запись частоты сцепления по отношению к времени контакта кривой с использованием по меньшей мере три различные пары ячейки для каждого контакта время, чтобы получить среднее и SEM.
4. Запись неспецифического связывания кривой для управления с помощью эритроцитов покрыта не имеет значения лигандов (например, BSA) и / или блокирование лигандами или рецепторами, используя их специфические функциональные МАТ блокады. Конкретные частоты адгезии в каждой точке времени контакта могут быть рассчитаны путем удаления неспецифических частоты адгезии ^1.

ove_title "> 7. Анализ данных

1. Установите определенную частоту адгезии Р по сравнению с временем контакта т данных вероятностной модели (уравнение 1), который описывает второго порядка вперед и первого порядка, наоборот, пошагового взаимодействия отдельных видов рецепторов и отдельных видов лигандов ¹ :
   
   где К является эффективным 2D сродство, к _{выключение} пределы скорости, м _г и т _л соответствующих рецепторов и лигандов плотность измеряется в шаге 4, и _с-зоны контакта. Кривая посадки имеет два параметра, _С К и А _прочь, как _С и К являются валить в одну кучу, и призвал все вместе как эффективный 2D близости. Ее продукт от курса является эффективным 2D на курс: _с к _о = _С К х к _с.
   Специфическую адгезию частоты P рассчитывается путем вычитания неспецифического фракция адгезии (Р _{неспецифический)} от общего измеряется адгезии (Р _{измеряется)} ^1,21:
   

8. Представитель Результаты:

Рисунок 1 Определение интегрина α _L β ₂ сайта плотности на нейтрофилов. Нейтрофилы сначала инкубируют с 1μg/ml Е-селектина-Ig в течение 10 минут, чтобы соответствовать экспериментальных условий, используемых в цифрах 3,4 или без Е-селектина-Ig, а затем с насыщающей концентрации (10μg/ml) ПЭ-сопряженных анти -человек CD11a МКА (Clone HI111, см. таблицу конкретныхреактивов и оборудования) или не имеют отношения IgG1 мыши для управления, промывают, и проанализированы немедленно. Образцы читать BD LSR потока цитометр со стандартными бисером QuantiBRITE PE калибровки. Группа показывает флуоресценции гистограммы калибровки шариков (розовый) вместе с теми, Е-селектина-Ig лечение (синего цвета) или необработанных клетках (зеленый цвет). Конкретные CD11a мАт окрашивания показана на сплошные линии и неуместные изотипа соответствием окрашивания контроль антител показано на пунктирной кривой. Клетки обрабатывали E-селектина-Ig (присутствие во всех стиральных шаги и в буферных FACS) не влияет на плотность CD11a как видно из сравнения с необработанными клетками. Группа B показан процесс плотности количественной оценке. Log10 была рассчитана для средней интенсивности флуоресцентного (FI) каждого пиковое значение из четырех калибровки гистограммы борт от группы (розовые кружки) и для многих конкретных PE молекул в шарик (от производителя). Линейной регрессии Log10 молекул полиэтилена в шарик против Log10 fluorescENCE была снята. Для E-селектина обработанных клеток Log10 FI (у) значений, равных 3.99 (синий сплошной кружок) и 2.23 (синий открытый круг) для конкретных МАБ и контроль антител, respectivly. Мы решили линейное уравнение для х (значения приведены в виде зеленых и синих кругов на группы В) х = Log10 PE / клеток и, как полиэтилен. МАт соотношение было 1:1, общее количество α _L β ₂ на нейтрофилов рассчитывается как 9587. Поверхностная плотность рассчитывалась для 43 молекул / мкм ^2, используя 8.4μm как диаметр нейтрофилов ^22. Плотность ICAM-1 было так же измеряется поток cytometery использованием PE-анти-CD54 МКА человека, который составил 65 моль / мкм ^2.

На рисунке 2 схемы микропипетки системы. Наши микропипетки система собиралась в доме и состоит из трех подсистем: подсистемы визуализации чтобы можно было наблюдать, рекомендацияог и анализа движения микропипетки атмосферный клетки; микроманипуляция подсистемы, чтобы можно было выбрать ячейки от ячейки камеры, и давление подсистемы позволяют аспирации клеток в микропипетки. Центральная часть подсистемы визуализации инвертированного микроскопа (Olympus IMT-2 IMT2) с 100х масляной иммерсии 1,25 цель NA. Изображение передается на кассетный видео через прибор с зарядовой пара (ПЗС) камеры. Видео таймер соединен с системой, чтобы следить за временем. Каждый микропипетки могут манипулировать механический привод монтируется на микроскоп и мелко позиционируется с трехосной гидравлического микроманипулятора. Механические манипуляторы из Ньюпорта могут быть использованы также. Один из микропипетки держателей устанавливается на пьезоэлектрический переводчик, водитель которого находится под контролем компьютера LabView код (предоставляется по запросу), а сигнал переводит через борт DAQ через усилитель напряжения (самодельный) на привод пьезо. Этоllows один двигаться пипеткой точно и repeatably в цикл испытаний адгезии. Подсистема регулирования давления используется для контроля всасывания в ходе эксперимента. Гидравлическая линия соединяет микропипетки владельцу, резервуар для жидкости. Тонкой механической позиционер позволяет высота резервуара точно манипулировать.

Микропипетки генерируются с использованием Kimax плавления боросиликатного стекла капилляров (с внешним диаметром 1,0 ± 0,07 мм и внутренним диаметром 0,7 ± 0,07 мм. Во-первых, микропипетки из капилляров тянут использования PN-30 Магнитные Narishige "Стекло Микроэлектродные Горизонтальное Puller (Саттер инструменты микропипетки Puller другой съемник опция). Во-вторых, Microforge системы (построен в дом) используется для резки микропипетки до нужного размера отверстия. Коммерческие модели систем Microforge также доступны.

Для того чтобы избежать вибрации микропипетки в ходе эксперимента, microscОПЕ, наряду с микроманипуляторами, помещается на стол пневматическая подвеска.

Рисунок 3 Запуск F адгезии частоте _я для конкретных (А) и неспецифические (B) обязательным на 1 сек (красный) и 10 с (синий) времени контакта измеряется от повторяющихся циклов испытаний адгезии между эритроцитов покрыта ICAM-1 (А) или hIgG (B ) с нейтрофилов человека выразить интегрина α _L β _2. F _я = (X ₁ + X ₂ + ... + X _я) / я (1 ≤ ≤ п), где я есть индекс испытательного цикла, X _я равным «1» (адгезия) или "0" (без сцепления). F _{п (п} = 50) был использован в качестве наилучшей оценки для адгезии вероятности.

Рисунок 4 КинетикаICAM-1 привязки к нейтрофилов интегрина α _L β ₂ ( ). Адгезия вероятность измеряется как показано на рисунке 3 на три ячейки пар на каждый контакт времени усредняется и построены по сравнению с временем контакта. Камера среды HBSS с 1 мМ каждого из Са ^{2 +} и Mg ^{2 +} плюс 1μg/ml димерных E-селектина-Ig к upregulate α _L β ₂ обязательными. Для захвата ICAM-1-Ig на эритроцитах, промежуточный шаг был добавлен для инкубации эритроцитов с антителами 10μg/ml захвата (биотинилированного козьего анти-человеческий Fc антитела, eBioscience) после инкубации стрептавидин шаг. Для контроля неспецифического связывания двух различных условиях были использованы: 1) эритроцитов покрыта анти-человек-Fc захвата антител и инкубировали с человеческим IgG, а не ICAM-1-Ig (O) и 2) нейтрофилов привязка к БС не покрытые захват антитела (Δ). 10μg/ml человеческого IgG был добавлен в среду, чтобы минимизировать связывание E-Селектина-Ig в растворе, чтобы захватить антител на поверхности эритроцитов. Неспецифическое связывание записан как человеческие кривой IgG контроля был использован для получения конкретной кривой вероятность адгезии ( ) По формуле. 2. Установка конкретной кривой вероятность адгезии с формулой. 1 (сплошная линия) вернулся эффективное сродство _с К = 1,4 • 10 ^-4 μm4 а к _с = 0,3 с ^-1.

Реагент	МВт (г / моль)	Концентрация (мМ)	Сумма (г)
Аденин	135,13	2	0,27
D-глюкозы (декстрозы)	180,16	110	19,82
D-маннитол	182,17	55	10,02
Хлорид натрия (NaCl)	58,44	50	2,92
Фосфат натрия, Диаммоний (Na HPO )	141,95	20	2,84
L-глютамин	146,15	10	1,46

Таблица 1. EAS-45 буфер подготовки (1L).

25 мг биотин-XHS в 550 мкл ДМФ	0,1 М раствор биотин
1:10 разбавления 0,1 биотин ж / DMF	0,01 М раствор биотин
1:100 разбавления 0,1 биотин ж / DMF	0,001 биотин решение

Таблица 2. Приготовление раствора биотин.

биотин конечная концентрация (мкМ)	4	10	20	50	100	160
Эритроциты гранул запаса (мкл)	10	10	10	10	10	10
1x PBS (мкл)	179,2	178	176	179	178	176,8
0,1 М боратном буфере (мкл)	10	10	10	10	10	10
0,01 М раствор биотин (мкл)				1	2	3,2
0,001 биотин решение (мкл)	0,8	2	4

Таблица 3. Биотинилирование эритроцитов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Чтобы успешно использовать частоты микропипетки адгезии анализа следует учитывать несколько важных шагов. Во-первых, убедитесь, что для записи конкретного взаимодействия рецептор-лиганд системы интересов. Неспецифические контрольные измерения (см. рис. 3, 4) обеспечить специфичность. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Catalogue #	Комментарии
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Развести до 1х деионизированной водой перед использованием
Vacutainer ЭДТА	BD	366643	Эритроциты изоляции
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Эритроциты изоляции
Аденин	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 подготовка
D-глюкозы (декстрозы)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 подготовка
D-маннитол	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 подготовка
Хлорид натрия (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 подготовка
Фосфат натрия, Диаммоний (Na & # х2082; HPO ₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 подготовка
L-глютамин	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 подготовка
Биотин-X-NHS	Calbiochem	203188	Эритроциты биотинилирование
Диметилформамид (DMF)	Thermo Scientific	20673	Эритроциты биотинилирование
Борат буфера (0,1 М)	Электронная микроскопия наук	11455-90	Эритроциты биотинилирование
Стрептавидином	Thermo Scientific	21125	Лиганд функционализация
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Лиганд функционализация
Quantibrite PE бисер	BD Biosciences	340495	Плотность количественного
Проточный цитометр	BD Immunocytometry системы	BD LSR II	Плотность квантовыхкации
Капиллярная трубка 0.7-1.0мм х 30 "	Кимбл стекла ООО	46485-1	Микропипетки потянув
Минеральное масло	Fisher Scientific	BP2629-1	Палата сборки
Стекло микроскопа Обложка	Fisher Scientific	12-544-G	Палата сборки
PE-α человека CD11a Клон HI 111	eBioscience	12-0119-71	Реагент для Рис.1
PE анти-CD54 человека	eBioscience	12-0549	Реагент для Рис.1
Мышь IgG1 Изотип управления PE	eBioscience	12-4714	Реагент для Рис.1
гидравлического микроманипулятора	Narishige	MO-303	Микропипетки системы
Механический манипулятор	Ньюпорт	461-XYZ-м, SM-13, ДУ-13	Микропипетки системы
пьезоэлектрических переводчик	Physik Instrumente	P-840	Микропипетки системы
LabVIEW	National Instruments	Версия 8,6	Микропипетки системы
DAQ борту	National Instruments	USB-6008	Микропипетки системы
Оптический стол	Кинетика системы	Серии 5200	Микропипетки системы