Essai Fréquence d'adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l'interface cellule-cellule

Résumé

Un test de fréquence pour mesurer la cinétique de l'adhérence d'interaction récepteur-ligand, lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules en interaction est décrite. Ce test mécanique à base est illustrée à l'aide d'une micropipette pressurisés cellules rouges du sang humain en tant que capteur d'adhérence et de l'intégrine αLβ2 et de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 que l'interaction des récepteurs et des ligands.

Résumé

Le test d'adhérence micropipette a été développé en 1998 pour mesurer deux dimensions (2D) récepteur-ligand cinétique de liaison ^1. L'essai utilise un globule rouge humain (RBC) en tant que capteur d'adhérence et de cellules présentant l'une des molécules en interaction. Elle emploie micromanipulation pour amener le RBC en contact avec une autre cellule qui exprime la molécule interagissant avec d'autres zone contrôlée avec précision et le temps pour permettre la formation de liaison. L'événement d'adhérence est détecté comme un allongement de RBC sur la tirant les deux cellules à part. En contrôlant la densité des ligands immobilisés sur la surface du globule, la probabilité de l'adhésion est maintenu à la mi-chemin entre 0 et 1. La probabilité d'adhérence est estimée à partir de la fréquence des événements d'adhésion dans une séquence de cycles de contacts répétés entre les deux cellules pour un temps de contact donné. Varier le temps de contact génère une courbe de liaison. Le montage d'un modèle probabiliste pour récepteur-ligand de réaction cinétique de ¹ à la liaisoncourbe de revient de l'affinité 2D et hors-taux.

Le test a été validé en utilisant des interactions avec des récepteurs Fcy IgG Fc ^1-6, avec des ligands des sélectines glycoconjugués ^6-9, les intégrines avec des ligands ^10-13, homotypical cadhérine contraignante ^14, récepteur des cellules T et des complexes d'histocompatibilité corécepteur peptide-major ^{15 - 19.}

La méthode a été utilisée pour quantifier les règlements de la cinétique 2D par des facteurs biophysiques, comme la membrane microtopology ^5, la membrane d'ancrage ^2, l'orientation moléculaire et de la longueur ^{6, 9} raideurs transporteur, la courbure ²⁰ et ²⁰ vigueur impact, ainsi que les facteurs biochimiques, tels que des modulateurs du microenvironnement du cytosquelette et la membrane où les molécules interagissant résident et l'organisation de surface de ces molécules ^15,17,19.

La méthode a également été utilisé to Etude de la liaison simultanée de deux espèces récepteur-ligand ^3,4, et les interactions trimoléculaire ^{19 en} utilisant un modèle modifié ^21.

L'avantage majeur de cette méthode est qu'elle permet l'étude des récepteurs membranaires dans leur environnement natif. Les résultats pourraient être très différents de ceux obtenus en utilisant des récepteurs purifiés ^17. Il permet également d'étudier les interactions récepteur-ligand dans un délai inférieur à la seconde avec une résolution temporelle bien au-delà des méthodes typiques biochimiques.

Pour illustrer la méthode de fréquence micropipette adhésion, nous montrons mesure cinétique de la molécule d'adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) fonctionnalisés sur les globules rouges se liant à l'intégrine α _L β ₂ sur les neutrophiles avec des dimères de la E-sélectine dans la solution pour activer α _L β _2.

Protocole

1. Isolément les globules rouges du sang total

1. Préparer EAS-45 solutions. Pesez tous les ingrédients dans le tableau I et dissoudre dans 100-200ml d'eau déminéralisée. Ajouter de l'eau pour préparer une solution 1000ml et ajuster le pH à 8,0. Filtrez et aliquote de 50 ml. Congeler à -20 ° C pour le stockage.

Remarque: l'étape 1.2 doit être effectuée par un médecin formé professionnel comme une infirmière, avec un Institutional Review Board protocole approuvé.

2. Dessinez 3-5ml de sang de la veine médiane cubitale dans un tube de 10ml contenant de l'EDTA et mélanger délicatement le sang avec EDTA immédiatement et abondamment pour éviter la coagulation.
3. Échantillon de sang processus dès que possible. Toutes les étapes suivantes, sauf centrifugation devrait être fait sous le capot de garder la préparation stérile. Transfert du sang dans un tube de 50ml centrifugeuse, ajouter 10ml de Histopaque froide et stérile 1077 et centrifuger pendant 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Répéter deux fois.
4. Ajouter 10ml de PBS froid et stérile, centrifuger pendant 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Enlever le surnageant. Répétez 4 fois (5 fois au total).
5. Laver à l'stériles EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) à deux reprises. Pendant les dernières globules rouges se laver dans un nouveau tube 15ml stérile.
6. Resuspendre globules rouges EAS-45 in10ml.

2. Biotinylation globules rouges

1. Prenez le tube avec les globules rouges de l'étape 1. Retirez tous surnageant après centrifugation pendant 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Mettez 10 pi de globules rouges granulés à chacun de plusieurs flacons et ajouter le montant correspondant de PBS dans chaque flacon (voir tableau II pour exemple de préparation de six concentrations différentes globules rouges biotinylation).
2. Faire frais Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 dilutions selon le tableau II.
3. Ajouter 10 pi de tampon borate 0,1 M à chaque flacon.
4. Ajouter la quantité calculée de solution de biotine dans chaque flacon (voir tableau II comme, par exemple) et le vortex immédiatement.
5. Placer chaque flacon de RBCintérieur d'un tube conique de 50 ml et incuber sur des rotateurs pendant 30min à température ambiante.
6. Laver chaque flacon 3 fois avec 800μl d'EAS-45 pour 2min @ 2000rpm.
7. Ajouter 100 pi d'EAS-45 à chaque flacon et stocker à 4 ° C. Dans chaque 1 microlitre de la solution finale doit être désormais ~ 1mln des globules rouges.

3. La fonctionnalisation de la biotine * lié ligands sur les globules rouges

1. Préparer 2mg/ml streptavidine solution selon les instructions du fabricant. Solution Aliqouted peuvent être stockés à -20 ° C.
2. Mélangez une quantité égale de globules rouges de l'étape 2.7 (10 ul) avec une solution de streptavidine, vortex immédiatement et incuber sur des rotateurs pendant 30min à 4 ° C.
3. Laver 3 fois avec 500μl d'EAS-45 pour 2min @ 2000rpm. Ajouter 15μl EAS-45% de BSA / 1 pour le stockage.
4. Mélanger la même quantité de globules rouges de l'étape 3.3 (10 ul) avec solution de ligand 20μg/ml, vortex immédiatement et incuber sur des rotateurs pendant 30min à température ambiante.
5. Laver deux fois avec 500μl d'EAS-BSA 45 / 1% pour 2min @ 2000rpm. Ajouter 15μl de BSA EAS-45 / 1% pour le stockage.

* Si votre protéine n'a aucun lien de biotine, vous pouvez utiliser un des kits disponibles dans le commerce d'une biotinylation de protéines (par exemple, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro-NHS-PEG4 Biotinylation Kit) ou d'utiliser des anticorps biotinylés capture comme une étape intermédiaire comme le montre dans la vidéo.

4. Quantification des densités de récepteurs et des ligands

1. Incuber ligand enduit de globules rouges de l'étape 3 et, dans un autre flacon, porteurs de récepteurs des cellules avec des concentrations saturantes de mAb respectifs pendant 30min à température ambiante. Incuber les cellules avec des flacons séparés pertinent apparié par isotype des anticorps pour le contrôle. Si les anticorps primaires ne sont pas marqués par fluorescence, incuber avec fluorescence des anticorps secondaires conjugués conformément aux instructions du fabricant.
2. Analyser des échantillons préparés à l'étape 4.1 par cytometery débit avec correspondants fluorescentes calperles ibration. Calculer la densité, comme indiqué dans la Fig. 1.

5. Préparation pour micropipette et la chambre cellulaire

1. Tirez Micropipettes de tubes capillaires en utilisant PN-30 Narishige 'extracteur magnétique microélectrodes de verre horizontale ou Sutter Instruments Micropipette Puller.
2. Utilisez micromanipulateur avec microforge d'ajuster la pointe de la micropipette tiré à une taille souhaitée (généralement les plages de diamètre requis de 1-5 pm en fonction de la taille des cellules pour être utilisé dans l'étude).
3. Préparer la chambre de la cellule en coupant le verre Couvercle Microscope à la taille désirée. Sceau de la chambre de l'huile minérale à l'aide des deux côtés pour éviter l'évaporation moyenne de changer l'osmolarité pendant l'expérience.
4. Ajouter les cellules réceptrices et ligand-portant à la chambre.

6. Dosage de la fréquence d'adhérence Micropipette

1. Aspirer les cellules interagissant par des pipettes respectifs et l'utilisation des ordinateurs programmés piezoelectr Traducteur IC à conduire le RBC dans et hors de contact avec l'autre cellule avec la zone de contact contrôlé et le temps. Détecter des événements d'adhérence en observant un allongement de RBC sur la séparation des cellules.
2. Répétez le cycle de contact-rétraction 50-100 fois pour un temps de contact donné. Enregistrez les événements d'adhésion observés en ajoutant "1" pour l'adhésion ou "0" pour aucune adhérence dans une colonne de tableur Excel. Vous pouvez utiliser un appareil d'enregistrement, par exemple, les médias numériques ou vidéo, pour les images microscopiques.
3. Enregistrement de la fréquence d'adhérence en fonction courbe de temps de contact en utilisant au moins trois paires de cellules différentes pour chaque temps de contact pour obtenir une moyenne et SEM.
4. Enregistrer la courbe de fixation non spécifiques pour le contrôle en utilisant les globules rouges enduits de ligands non pertinentes (par exemple, BSA) et / ou le blocage des ligands ou des récepteurs utilisant leur Acm spécifiques blocus fonctionnelle. Fréquence d'adhésion spécifiques à chaque point de temps de contact peut être calculée par l'élimination de la fréquence d'adhérence non spécifique ^1.

ove_title "> 7. Analyse des données

1. Monter la fréquence d'adhésion spécifiques données par rapport à P _un temps de contact t par un modèle probabiliste (équation 1) qui décrit un second ordre de l'avant et de premier ordre inverse, en une seule étape d'interaction entre une espèce unique de récepteurs et une seule espèce de ligands ¹ :
   
   où K _a est la 2D affinités efficaces contraignant, k est _hors du hors-taux, _R et M m _L sont les récepteurs respectifs et des densités de ligand mesurée à l'étape 4, et A _c est la zone de contact. La courbe d'ajustement a deux paramètres, A _c K _a et k _off, comme un _C et K _a sont regroupés et ont appelé collectivement comme une affinité 2D efficace. Son produit avec le hors-taux est le effective 2D sur des taux: un _c = k _sur A _c K _un k x _off.
   L'adhérence spécifique de fréquence P _a est calculée par soustraction de la fraction d'adhérence non spécifique (P _{non spécifique)} de l'adhésion totale mesurée (P _mesurée) ^1,21:
   

8. Les résultats représentatifs:

Figure 1: Détermination de l'intégrine α _L β ₂ densité du site sur les neutrophiles. Les neutrophiles ont d'abord été incubées avec des 1μg/ml E-sélectine-Ig pour 10min pour correspondre à la condition expérimentale utilisée dans les figures 3,4 ou sans E-sélectine-Ig, et ensuite avec des concentrations saturantes (10μg/ml) de PE-conjugué anti- -humain CD11a mAb (Clone HI111, voir le tableau des particuliersréactifs et du matériel) ou IgG1 de souris non pertinentes pour le contrôle, lavées, et analysées immédiatement. Les échantillons ont été lus sur cytomètre de flux BD LSR avec des perles QuantiBRITE étalon PE. Le panneau A montre les histogrammes de fluorescence des billes de calibration (rose) avec celles de la E-sélectine-Ig cellules traitées (couleur bleu) ou non traitées (couleur verte). Spécifiques CD11a mAb coloration est montré dans les courbes solides et pertinents coloration apparié par isotype d'anticorps de contrôle est représenté dans les courbes en pointillés. Les cellules traitées avec la E-sélectine-Ig (présence dans tous les étapes de lavage et dans un tampon de FACS) n'a pas d'incidence sur la densité CD11a vu de la comparaison avec les cellules non traitées. Groupe B montre le processus de quantification de densité. Log10 a été calculé pour l'intensité moyenne fluorescentes (FI) de chaque valeur de crête de quatre histogrammes billes de calibration à partir du Panneau A (cercles roses) et pour les molécules PE spécifique du lot par bille (du fabricant). Une régression linéaire de molécules PE Log10 par bille contre la Log10 fluorescrence a été tracée. Pour la E-sélectine des cellules traitées Log10 FI (y) des valeurs égales 3,99 (cercle bleu solide) et 2,23 (bleu cercle ouvert) pour des anticorps monoclonaux spécifiques et des anticorps de contrôle, respectivly. Nous avons résolu l'équation linéaire pour x (les valeurs sont tracées comme des cercles vert et bleu sur le panneau B) x = log10 PE / cellule et, comme PE:. Ratio de mAb était de 1:1, le nombre total d'α _L β ₂ sur les neutrophiles était calculé comme 9587. La densité de surface a été calculée à 43 molécules / um ^2, en utilisant 8.4μm que le diamètre des neutrophiles ^22. Densité de ICAM-1 était également mesurée par écoulement à l'aide cytometery PE-anti-humains CD54 monoclonal, ce qui équivalait à 65 mol / um ^2.

Figure 2 schémas des systèmes Micropipette. Notre système micropipette a été assemblé dans la maison et se compose de trois sous-systèmes: un sous-système d'imagerie permettant d'observer, record et d'analyser les mouvements de la cellule micropipette-atmosphérique; un sous-système de micromanipulation pour permettre de sélectionner les cellules de la chambre de la cellule, et un sous-système de pression pour permettre d'aspirer les cellules dans des micropipettes. La pièce centrale du sous-système d'imagerie est microscope inversé (Olympus IMT-2 IMT2) avec un objectif à immersion 100x 1,25 NA. L'image est envoyée à un enregistreur de cassette vidéo à travers un dispositif à couplage de charge (CCD). Une minuterie vidéo est couplé au système de garder trace du temps. Chaque micropipette peut être manipulé par un entraînement mécanique montée sur le microscope et finement positionné avec un micromanipulateur trois axes hydrauliques. Manipulateurs mécaniques de Newport pourrait être utilisé aussi bien. L'un des détenteurs micropipette est monté sur un translateur piézoélectrique, le conducteur est contrôlé par un code informatique LabView (disponible sur demande) et les traduit signal à travers une carte DAQ via un amplificateur de tension (fait maison) à l'actionneur piézo-électrique. Ceci est unllows de se déplacer la pipette précise et reproductible dans un cycle de test d'adhérence. Le sous-système de régulation de pression est utilisé pour contrôler d'aspiration pendant l'expérience. Une ligne hydraulique relie le titulaire micropipette à un réservoir de fluide. Un positionneur mécanique fine permet à la hauteur du réservoir pour être manipulé avec précision.

Micropipettes sont générés en utilisant la fusion Kimax tubes capillaires en verre borosilicate points (avec un diamètre extérieur de 1,0 ± 0,07 mm et un diamètre intérieur de 0,7 ± 0,07 mm. Abord, les micropipettes de tubes capillaires sont tirés à l'aide PN-30 Narishige 'extracteur magnétique microélectrodes de verre horizontale (Sutter Instruments Micropipette Extracteur est une autre option extracteur). Deuxièmement, le système microforge (construit dans la maison) est utilisé pour couper les micropipettes à l'ouverture de la taille désirée. modèles commerciaux de systèmes microforge sont disponibles aussi bien.

Pour éviter les vibrations de l'micropipettes pendant l'expérience, le microscOPE, avec les micromanipulateurs, est placé sur une table de suspension à air.

Figure 3 Exécution fréquence F _i pour une adhérence spécifique (A) et non spécifiques (B) se liant à 1s (rouge) et 10s temps de contact (en bleu) mesurée à partir des cycles répétés test d'adhérence entre les globules rouges revêtus d'ICAM-1 (A) ou hIgG (B ) avec des neutrophiles humains exprimant l'intégrine α _L β _2. F _i = (X ₁ + X ₂ + ... + X _i) / i (1 ≤ i ≤ n), où i est l'indice du cycle d'essai, X _i est égal à "1" (adhérence) ou "0" (pas d'adhérence). F _{n (n} = 50) a été utilisé comme la meilleure estimation de la probabilité d'adhérence.

Figure 4 Cinétique deICAM-1 se liant à des neutrophiles intégrine β α _{L 2} ( ). La probabilité d'adhésion mesurée, comme illustré dans la Figure 3 pour les trois paires de cellules à chaque temps de contact est en moyenne et la portée en fonction du temps de contact. Le milieu de chambre a été HBSS avec 1 mM chacun de Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +} en plus du dimère 1μg/ml E-sélectine-Ig à réguler positivement β α _{2 L} contraignant. Pour capturer l'ICAM-1-Ig sur les globules rouges, une étape intermédiaire a été ajouté à incuber avec des anticorps de capture globules rouges 10μg/ml (biotinylé de chèvre anti-anticorps humain Fc, eBioscience) après l'étape d'incubation streptavidine. Pour contrôler la liaison non spécifique deux conditions différentes ont été utilisées: 1) les globules rouges enduits de l'anticorps de capture anti-humain-Fc et incubées avec des IgG humaines au lieu d'ICAM-1-Ig (O) et 2) se liant à des neutrophiles globules rouges n'est pas revêtu de la captage d'anticorps (Δ). 10μg/ml IgG humaines a été ajouté au milieu afin de minimiser la liaison de E-Sélectine-Ig dans la solution d'anticorps de capture sur la surface du globule. La liaison non spécifique enregistrée IgG humaines contrôle de la courbe a été utilisée pour obtenir une courbe d'adhérence spécifiques probabilité ( ) En utilisant l'équation. 2. Ajustement de courbe spécifiques de probabilité d'adhésion avec Eq. 1 (ligne continue) retourné efficaces affinité de liaison A, K = 1,4 _{c une} μm4 • 10 ^-4 et k _off = 0,3 s ^-1.

Réactif	MW (g / mol)	Concentration (mM)	Montant (g)
Adénine	135,13	2	0,27
D-glucose (dextrose)	180,16	110	19,82
D-mannitol	182,17	55	10,02
Chlorure de sodium (NaCl)	58,44	50	2,92
Phosphate de sodium dibasique (Na HPO )	141,95	20	2,84
L-glutamine	146,15	10	1,46

Tableau 1. Préparation EAS-45 tampon (1L).

25 mg de biotine dans 550 ul XHS de DMF	0,1 M biotine solution
Dilution 1:10 de 0,1 biotine w / DMF	0,01 biotine solution
1:100 dilution de 0,1 biotine w / DMF	0,001 M la biotine solution

Tableau 2. Préparation de la solution de biotine.

biotine concentration finale (M)	4	10	20	50	100	160
Globules rouges granulés de stock (ul)	10	10	10	10	10	10
1x PBS (ul)	179,2	178	176	179	178	176,8
0,1 M de tampon borate (ul)	10	10	10	10	10	10
0,01 biotine solution (ul)				1	2	3.2
0,001 M la biotine solution (ul)	0.8	2	4

Tableau 3. Biotinylation de globules rouges.

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Discussion

Pour utiliser avec succès le test de fréquence d'adhérence micropipette on doit considérer plusieurs étapes critiques. Premièrement, assurez-vous d'enregistrer les interactions spécifiques pour le système récepteur-ligand d'intérêt. Mesures de contrôle non spécifiques (cf. Fig. 3, 4) assurer la spécificité. Idéalement, les probabilités d'adhérence non spécifique doit être inférieur à 0,05 pour toutes les durées de contact et d'avoir une différence significative entre les proba...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Catalogue #	Commentaires
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Diluer à 1x à l'eau déminéralisée avant de l'utiliser
Vacutainer EDTA	BD	366643	Isolément les globules rouges
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Isolément les globules rouges
Adénine	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 la préparation
D-glucose (dextrose)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 la préparation
D-mannitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 la préparation
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 la préparation
Phosphate de sodium dibasique (Na & # x2082; HPO ₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 la préparation
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 la préparation
Biotine-X-NHS	Calbiochem	203188	Biotinylation globules rouges
Diméthylformamide (DMF)	Thermo Scientific	20673	Biotinylation globules rouges
Tampon borate (0,1 M)	Sciences Electron Microscopy	11455-90	Biotinylation globules rouges
Streptavidine	Thermo Scientific	21125	Ligand fonctionnalisation
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand fonctionnalisation
Quantibrite Perles PE	BD Biosciences	340495	La quantification de densité
Cytomètre en flux	BD Systèmes Immunocytometry	BD LSR II	Densité Quantification
Tube capillaire 0.7-1.0mm x 30 "	Kimble Glass Inc	46485-1	Micropipette tirant
Huile minérale	Fisher Scientific	BP2629-1	Chambre de l'Assemblée
Verre Couverture Microscope	Fisher Scientific	12 à 544-G	Chambre de l'Assemblée
PE α-humain CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	Réactif pour Fig.1
PE anti-humain CD54	eBioscience	12-0549	Réactif pour Fig.1
Souris IgG1 isotype contrôle PE	eBioscience	12-4714	Réactif pour Fig.1
micromanipulateur hydraulique	Narishige	MO-303	Micropipette système
Manipulateur mécanique	Newport	461-XYZ-M, LM-13, DM-13	Micropipette système
translateur piézoélectrique	Physik Instrumente	P-840	Micropipette système
LabVIEW	National Instruments	Version 8.6	Micropipette système
DAQ conseil d'administration	National Instruments	USB-6008	Micropipette système
Table optique	Kinetics Systems	Série 5200	Micropipette système