에 대한 접착 주파수 분석 현장에서 속도론 해석

요약

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

초록

micropipette 부착 분석은 2 차원 (2D) 수용체 - 리간드 바인딩 속도론 ¹ 측정하기 위해 1998 년에 개발되었습니다. 분석은 부착 센서와 상호 작용하는 분자 중 하나를 제시 세포로 인간의 적혈구 (RBC)를 사용합니다. 그것은 정확하게 제어 영역과 결합 형성을 활성화하기 위해 시간과 다른 상호 작용하는 분자를 표현 다른 세포와 접촉에 RBC를 가지고 미세 조작을 사용합니다. 접착 이벤트가 떨어져 두 세포를 당기시 RBC의 신장으로 감지됩니다. RBC 표면에 고정화 리간드의 밀도를 조절하여 접착의 확률은 0과 1 사이의 미드 레인지에 보관됩니다. 유착 확률은 주어진 접촉 시간이 두 세포 사이의 접촉 반복주기의 순서에 유착 사건의 주파수 추정된다. 연락처 시간을 변화하는 것은 바인딩 커브를 생성합니다. 바인딩 수용체 - 리간드 반응 속도론 ¹ 확률적 모델 피팅곡선은 2D 친화력과 오프 속도를 반환합니다.

분석은 IgG FC ^1-6 glycoconjugate 리간드 ^6-9, 리간드 ^10-13, homotypical cadherin 구속력이 ¹⁴ 펩타이드 - 주요 histocompatibility의 단지 ¹⁵ T 세포 수용체와 coreceptor과 integrins와 selectins과 Fcγ 수용체의 상호 작용을 사용하여 검증되었습니다 ^{- 19.}

방법은, 같은 멤브레인 microtopology ^5, 멤브레인 앵커 ^2, 분자 오리 엔테이션 및 길이 ^6, 캐리어 강성 ^9, 곡률 ^20과 충돌 힘 ^20,뿐만 아니라 생화 학적 요인 biophysical 요소에 의해 2D 속도론의 규정을 계량하는 데 사용되었습니다 상호 작용하는 분자가있는 cytoskeleton과 멤브레인 microenvironment하고 이러한 분자 ^15,17,19의 표면 조직의 모듈 레이터 등.

방법은 t에도 사용되고 있습니다O는 수정된 모델 ^21를 사용하여 이중 수용체 - 리간드 종 ^3,4의 동시 구속, ¹⁹ trimolecular 상호 작용을 공부합니다.

방법의 주요 장점은 자신의 기본 멤브레인 환경에서 수용체 연구를 허용한다는 것입니다. 결과는 정화 수용체 ^17를 사용하여 얻은 이들의 매우 다른 수 있습니다. 또한 잘 전형적인 생화학 방법을 넘어 시간적 해상도를 가진 하위 초 timescale에있는 수용체 - 리간드 상호 작용의 연구를 수 있습니다.

micropipette 부착 주파수 방법을 설명하기 위해, 우리는 α _L의 β ₂ 활성화 솔루션에 dimeric E - selectin과 neutrophils에서 인테 그린 α _L의 β ₂ 구속력 RBCs에 작용 세포 유착 분자 1 (ICAM - 1)의 속도론 측정을 보여줍니다.

프로토콜

1. 전체 혈액에서 RBCs 절연

1. EAS - 45 솔루션을 준비합니다. 테이블 내의 모든 재료를 무게 및 DI 워터 100 - 200ml에 용해. 1000ml 솔루션을 만들고 8.0 산도를 조정하기 위해 물을 추가합니다. 50ml에 의해 필터 나누어지는. 스토리지 -20 ° C에서 고정.

참고 : 단계 1.0 기관 검토위원회 승인을 프로토콜과 함께 간호사로 훈련 의료 전문가 등에 의해 수행되어야합니다.

2. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함 10ml 튜브에 평균 cubital 정맥에서 혈액 3 - 5ml를 그려 부드럽게 즉시 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 혈액을 혼합하고 철저하게 염증을 막을 수 있습니다.
3. 공정 혈액 샘플 가능한 한 빨리. 원심 분리를 제외한 모든 다음 단계는 준비가 멸균 유지하는 후드를 완료해야합니다. , 50ml 원심 튜브에 혈액을 전송 5 분 @ 1000rpm 4 ° C.에 대한 추위와 무균 1077 Histopaque 및 원심 분리기의 10ml를 추가 두 번 반복합니다.
4. 10 추가ML 추위와 멸균 PBS, 5 분 @ 1000rpm을위한 원심 분리기, 4 ° C. 뜨는을 제거합니다. 4 번 (5 번 총) 반복합니다.
5. 두번 무균 EAS​​ - 45 (5 분 @ 1000rpm, 4 ° C)로 씻으십시오. 새로운 멸균 15ml 튜브에 마지막으로 세척 이동 RBCs 동안.
6. Resuspend RBCs in10ml EAS - 45.

2. RBCs에 biotinylation

1. 1 단계에서 RBCs로 튜브를 가져가라. 5 분 @ 1000rpm 4 ° C.에 대한 centrifuging 후 모든 뜨는을 제거 여러 개의 튜브 각 RBCs 펠렛의 10μl를 넣고 (6 다양한 RBCs의 biotinylation의 농도의 준비 예를 들어 표 II 참조) 각 유리병에 PBS의 해당 금액을 추가합니다.
2. 표 II에 따라 신선한 Biotin-X-NHS/DMF 1시 10분, 1:100 dilutions하십시오.
3. 각 유리병에 0.1M borate 버퍼 10μl를 추가합니다.
4. 즉시 계산 각 유리병에 비오틴 솔루션의 금액 (예를 들어 표 II 참조)하고 와동을 추가합니다.
5. 각 RBC의 약병 장소50ml 원뿔 튜브 및 실온에서 30 분에 대한 회전에 품어 내부.
6. 2min @ 2000rpm을위한 EAS - 45의 800μl로 각 유리병 3 번씩 씻으십시오.
7. 4 각 유리병 및 저장하는 EAS - 45의 100μl를 추가 ° C. 최종 솔루션의 각각 1μl에 지금 RBCs의 ~ 1mln해야합니다.

3. RBCs에 비오틴 - 연결된 리간드 *을 Functionalizing

1. 제조 업체의 지침에 따라 2mg/ml streptavidin 용액을 준비합니다. Aliqouted 솔루션은 -20 ° C.에 저장될 수 있습니다
2. 즉시 streptavidin 솔루션, 소용돌이와 함께 스텝 2.7 (10μl)에서 RBCs의 동일한 금액을 혼합하고 4 30 분에 대한 회전에 품어 ° C.
3. 2min @ 2000rpm을위한 EAS - 45의 500μl 3 번 씻으십시오. 15μl EAS - 45 스토리지 / 1 % BSA를 추가합니다.
4. 즉시 20μg/ml 리간드 솔루션, 소용돌이와 함께 스텝 3.3 (10μl)에서 RBCs의 같은 양을 혼합하여 실온에서 30 분에 대한 회전에 품어.
5. 중 500μl로 두 번 씻으 EAS -2min @ 2000rpm에 대한 1분의 45 %의 BSA. 스토리지 EAS - 1분의 45 %의 BSA의 15μl를 추가합니다.

* 귀하의 단백질이 더 비오틴 링크가 없다면 당신은 단백질 biotinylation에 대한 상용 키트 중 하나를 (예를 들어, 써모 과학은 # 21955 EZ - 링크 마이크로 NHS - PEG4 - Biotinylation 키트)를 사용하거나 그림과 같이 중간 단계로 biotinylated 캡처 항체를 사용하여 동영상 인치

4. 수용체와 리간드 밀도의 부량

1. 각 mAbs의 포화의 농도와 다른 유리병, 수용체 - 베어링 세포 상온에서 30 분 동안 3 단계의 리간드 - 코팅 RBCs를 품어합니다. 제어를위한없는 isotype 검색 항체와 함께 별도의 튜브 세포에 품어. 기본 항체가 찬란 표시되지 않는 경우에는 제조 업체의 지시에 따라 찬란 - 복합 차 항체와 함께 품어.
2. 해당 형광 칼과 흐름 cytometery에 의해 단계 4.1 준비 샘플 분석ibration 비즈. 로 그림에 표시된 밀도를 계산합니다. 1.

5. micropipette과 셀 챔버 준비

1. PN - 30 Narishige '자기 유리 Microelectrode 수평 풀러 또는 셔터 인 스트 루먼트 Micropipette 풀러를 사용하여 모세관 튜브에서 micropipettes를 가져옵니다.
2. 원하는 크기 (보통 1 - 5μm에서 필요한 직경 범위 연구에 사용되는 세포의 크기에 따라)에 뽑아 micropipette의 팁을 조정 microforge과 micromanipulator를 사용하십시오.
3. 원하는 크기로 현미경 커버 유리를 절단하여 셀 챔버를 준비합니다. 실험 중에 osmolarity를​​ 변경하는 중간 증발을 방지하기 위해 양쪽에서 미네랄 오일을 사용하여 챔버를 밀봉합니다.
4. 실로 수용체와 리간드 - 베어링 세포를 추가합니다.

6. Micropipette 부착 주파수 분석

1. 각 pipettes하여 상호 작용하는 세포를 기음과 컴퓨터 프로그램 piezoelectr를 사용하여 IC 번역은 제어 문의 공간 및 시간이 다른 세포와 접촉 밖의 RBC를 운전합니다. 세포 분리시 RBC의 연신율을 관찰하여 접착 이벤트를 감지.
2. 주어진 접촉 시간에 대한 문의 - 철회주기에게 50-100 번 반복합니다. Excel 스프레드 시트의 열에서없이 접착을위한 접착 또는 "0"에 대한 "1"을 추가하여 관찰 부착 이벤트를 기록합니다. 당신은 미세한 이미지, 예를 들어, 디지털 미디어 또는 비디오 테이프를 녹화 장치를 사용할 수 있습니다.
3. 부착 주파수 대 의미와 SEM을 얻기 위해 각 접촉 시간에 적어도 세 가지 다른 세포 쌍을 사용하여 문의 시간 곡선을 기록합니다.
4. 그들의 구체적인 기능 봉쇄의 mAbs를 사용하여 리간드 또는 수용체를 차단없는 리간드 (예 : BSA) 및 / 또는 코팅 RBCs를 사용하여 컨트롤에 대한 특이 현상이 바인딩 커브를 기록합니다. 각 연락처 시점에서 특정 접착 주파수는 특이 현상이 부착 주파수 ¹ 제거하여 계산하실 수 있습니다.

ove_title "> 7. 데이터 분석

1. 특정 부착 주파수를 맞추기 P 전달 두번째 순서와 첫 순서 수용체의 단일 수종과 리간드 ¹ 단일 종 사이의 역방향 단일 단계 상호 작용을 설명하는 확률적 모델 (수식 1)에 의해 비교 ​​문의 시간 t 데이터 :
   
   _K는 2D 효과적인 바인딩 친화력은 K가 _오프 오프 요금은, M _R 및 M _난 4 단계에서 측정한 각각의 수용체와 리간드 밀도뿐입니다이며, _C는 접촉 영역입니다. 곡선 맞춤가 _{C와 K가} 효과적인 2D 친화 함께 일괄와 총칭이라고 같이 두 개의 매개 변수, _C K _A와 K _임무를 가지고 있습니다. 오프 속도의 제품은 효과적인 2D에서 속도입니다 _{C K에} = _C K X K _해제.
   구체적인 접착력 주파수 _P는 전체 측정 부착 (P _측정) ^1,21에서 특이 현상이 부착 분율 (P _{특이 현상)의} 뺄셈으로 계산됩니다 :
   

8. 대표 결과 :

인테 그린 α _L의 β neutrophils ₂ 사이트 밀도의 1 결정을 그림. Neutrophils 먼저 그림 3,4 또는 E - selectin - IG없이 사용하는 실험 조건을 일치하는 10 분에 대해 E - selectin - IG의 1μg/ml와 incubated 후 PE - 복합 백신의 포화의 농도 (10μg/ml)로되었습니다 인간 CD11a mAb (복제 HI111 특정 표를 참조시약 및 장비) 또는 컨트롤에없는 마우스 IgG1은 씻어하고, 즉시 분석했다. 샘플은 표준 QuantiBRITE PE 교정 비즈와 BD LSR 흐름 cytometer에 읽어되었습니다. 패널 A는 E - selectin - IG 처리 (파란색) 또는 치료 세포 (녹색)의 사람과 함께 교정 비즈의 형광 histograms (분홍색)을 보여줍니다. 특정 CD11a mAb의 얼룩은 고체 곡선과 관련이없는 isotype 검색 컨트롤 항체 얼룩이 곳곳에 곡선에 표시됩니다에 표시됩니다. 치료 세포와 비교에서 본대로 E - selectin - IG (모든 세탁 단계와 FACS 버퍼에 존재) 대우 세포는 CD11a 밀도에 영향을주지 않았다. 패널 B는 밀도 부량 과정을 보여줍니다. Log10는 패널에서 네 개의 교정 비드 histograms의 각 피크 값의 평균 형광 강도 (FI)에 대한 계산 (핑크 원)와 구슬 당 많은 특정 PE 분자에 대한 (제조 업체). Log10 fluoresc에 대한 비드 당 Log10 PE 분자의 선형 회귀줬어도 꾸몄다되었습니다. E - selectin 취급 전지 respectivly 3.99 (파란색 고체 동그라미)와 특이적인 mAb 및 제어 항체에 대해 2.23 (파란색 오픈 동그라미), 동등한 Log10 FI (Y) 값. 우리는 X (값이 패널 B에 녹색과 파란색 동그라미로 꾸몄다 있습니다)에 대한 선형 방정식을 해결 X = Log10 PE PE로 / 세포와, :., neutrophils에서 α _L의 β _2의 총 숫자는 mAb 비율이 1시 1분 있었다 9587으로 계산. 표면 밀도는 호중구 직경 ^22로 8.4μm를 사용하여, 43 분자 / μm의 ^두 것으로 계산되었다. ICAM - 1의 밀도는 마찬가지로 65 몰 / μm의 ² 말았네 PE - 안티 인간 CD54 mAb를 사용하여 플로우 cytometery에 의해 측정되었다.

그림 2 Micropipette 시스템 설계도. 우리 micropipette 시스템은 집에서 조립 세 서브 시스템으로 구성되어 있습니다되었습니다 이미징 서브 시스템을 하나, 레크 리에이션을 관찰할 수 있도록오드 및 분석 micropipette - aspirated 세포의 움직임, 하나 셀 챔버에서 세포를 선택할 수 있도록 미세 조작 서브 시스템 및 압력 서브 시스템은 하나 micropipettes로 세포를 대기음 수 있습니다. 이미징 서브 시스템의 중앙 조각은 100x 기름 침지 1.25 NA의 목적으로 (올림푸스 IMT - 2 IMT2) 현미경을 반전합니다. 이미지는 무료 커플 장치 (CCD) 카메라를 통해 비디오 카세트 레코더로 전송됩니다. 비디오 타이머는 시간을 추적할 수있는 시스템으로 결합됩니다. 각 micropipette은 현미경에 장착된 가늘게 3 축 유압 micromanipulator와 위치 기계적 드라이브로 조작하실 수 있습니다. 뉴 포트에서 기계 manipulators 역시 사용될 수 있습니다. micropipette 홀더 중 하나가 압전 변환기에 탑재의 드라이버는 압전 액추에이터에 전압 앰프 (수제)를 통해 컴퓨터를 LabView 코드 (요청시 사용 가능)와 DAQ 보드를 통해 신호 변환에 의해 제어됩니다. 이llows 한 접착 테스트 사이클에서 정확하고 repeatably 피펫 이동합니다. 압력 조절 시스템은 실험 기간 동안 흡입을 제어하는​​ 데 사용됩니다. 유압 라인은 액체 저수지에 micropipette 홀더를 연결합니다. 좋은 기계 포지셔너는 저수지의 높이를 정확하게 조작 수 있습니다.

Micropipettes는 KIMAX의 융점 borosilicate 유리 모세관 튜브 (1.0 이외의 직경 ± 0.07 mm와 0.7의 내부 직경 ± 0.07 mm를 사용하여 생성됩니다. 첫째, 모세관 튜브의 micropipettes가 PN - 30 Narishige '자기 유리 Microelectrode 수평 풀러를 사용 행진 (셔터 인 스트 루먼트 Micropipette 풀러 다른 풀러 옵션입니다.) 둘째, Microforge 시스템 (집에서 만든) 원하는 크기 오프닝에 micropipettes를 잘라하는 데 사용됩니다. Microforge 시스템의 상용 모델뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.

실험 microsc 동안 micropipettes의 진동을 방지하려면ope, micromanipulators와 함께 에어 서스펜션 테이블에 배치됩니다.

그림 _3을 위해서 접착 주파수 F를 실행하는 특정 (A) 및 특이 현상 (B) 1s (빨간색)에 구속하고 10 초 ICAM - 1 (A) 또는 hIgG와 코팅 RBCs 사이에 반복적으로 접착 테스트주기에서 측정 (파란색) 접촉 시간 (B ) 인테 그린 α _L의 β _2를 표현하는 인간 neutrophils과 함께. F _I = (X ₁ + X ₂ + ... + X _제가) / 전 (1 제가 테스트주기 색인 ≤ I ≤ N), X _난 "1"동일 (접착) 또는 "0"(노 부착). F _N (N = 50)가 부착 확률위한 최상의 견적로 사용되었다.

4 속도론 그림호중구 인테 그린 α _L의 β ₂ ICAM - 1 바인딩 ( ). 측정된 접착 확률은 각 연락처 시간 세 세포 쌍을 그림 3에 나와 평균입니다 문의 시간 대 꾸몄다. 챔버 매체 α의 _{L의 β에게이} 바인딩을 upregulate하는 1mM 칼슘 ² 각 ⁺ 및 MG ² dimeric의 ⁺ 플러스 1μg/ml E - selectin - IG와 HBSS했다. , RBCs에서 ICAM - 1 - IG를 캡처하기 위해 중간 단계는 streptavidin 보육 단계 후 10μg/ml 캡처 항체 (biotinylated 염소 - 안티 인간 FC 항체, eBioscience)와 RBCs를 부화 추가되었습니다. 특이 현상이 구속력이 두 가지 조건을 제어하는​​ 데 사용되었다 : 1)는 RBCs로 코팅된 아닌 반 인간 FC 캡처 항체로 코팅하고 그 대신 RBCs에 바인딩 ICAM - 1 - IG (O)과 2) neutrophils 인간의 IgG와 incubated (Δ) 항체를 캡처합니다. 10μg/ml 인간 IgG는 E의 바인딩 최소화하는 매체에 추가되었습니다RBC 표면에 캡처 항체에 용액에 - selectin - IG. 인간 IgG 제어 곡선로 기록 특이 현상이 바인딩은 특정 부착 확률 곡선을 (얻기 위해 사용되었다 ) EQ를 사용하여. 2. EQ와 피팅 특정 부착 확률 곡선. 1 (실선)은 효과적인 구속력 친화력 _C K = 1.4 • 10 ^-4 μm4와 K _해제 = 0.3의 ^-1를 반환했습니다.

시약	MW (g / 몰)	농도 (㎜)	금액 (G)
아데닌	135.13	이	0.27
D - 포도당 (덱스 트로 오스)	180.16	110	19.82
D - Mannitol	182.17	55	10.02
나트륨 염화물 (NaCl)	58.44	50	2.92
인산 나트륨, 이염 (나 HPO )	141.95	20	2.84
L - 글루타민	146.15	10	1.46

표 1. EAS - 45 버퍼 준비 (1L).

DMF의 550 μl 25 MG 비오틴 - XHS	0.1M 비오틴 솔루션
0.1 비오틴 W / DMF의 1시 10분 희석	0.01M 비오틴 솔루션
0.1 비오틴 W / DMF의 1:100 희석	0.001M 비오틴 솔루션

표 2. 비오틴 솔루션의 준비.

비오틴 최종 농도 (μm의)	4	10	20	50	100	160
RBCs 펠렛 주식 (μl)	10	10	10	10	10	10
1X PBS (μl)	179.2	178	176	179	178	176.8
0.1M borate 버퍼 (μl)	10	10	10	10	10	10
0.01M 비오틴 솔루션 (μl)				일	이	3.2
0.001M 비오틴 솔루션 (μl)	0.8	이	4

표 3. RBCs의 Biotinylation.

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토론

성공적으로 한 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다 micropipette 부착 주파수 분석을 사용합니다. 첫째, 관심의 수용체 - 리간드 시스템의 구체적인 상호 작용을 기록해야합니다. 특이 현상이 제어 측정 (그림 참조하라. 3, 4)는 특이성을 보장합니다. 이상적으로, 특이 현상이 부착 확률은 접촉 시간에 대한 기간이 0.05 이하이어야하며 각 시점에 대한 구체적이고 특이 현상이 부착 확률 사이의 상당?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 #	댓글
10X PBS	BioWhittaker	17 - 517Q	사용하기 전에 탈이온수와 1X로 희석
Vacutainer EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)	BD	366,643	RBCs 절연
10ML PK100
Histopaque 1077	시그마 - 올드 리치	10,771	RBCs 절연
아데닌	시그마 - 올드 리치	A2786	EAS - 45 준비
D - 포도당 (덱스 트로 오스)	시그마 - 올드 리치	G7528	EAS - 45 준비
D - Mannitol	시그마 - 올드 리치	6360	EAS - 45 준비
나트륨 염화물 (NaCl)	시그마 - 올드 리치	S7653	EAS - 45 준비
인산 나트륨, 이염 (나 & # X2082; HPO ₄)	피셔 과학	S374	EAS - 45 준비
L - 글루타민	시그마 - 올드 리치	G5763	EAS - 45 준비
비오틴 - X - 보건국	Calbiochem	203,188	RBCs에 biotinylation
Dimethylformamide (DMF)	써모 과학	20,673	RBCs에 biotinylation
Borate 버퍼 (0.1M)	전자 현미경 과학	11455-90	RBCs에 biotinylation
Streptavidin	써모 과학	21,125	functionalizing 리간드
BSA	시그마 - 올드 리치	A0336	functionalizing 리간드
Quantibrite PE 비즈	BD Biosciences	340,495	밀도 부량
흐름 cytometer	BD Immunocytometry 시스템	BD LSR II	밀도 콴tification
모세관 0.7 - 1.0mm X 30 "	킴블의 유리 주식 회사	46485-1	Micropipette 당겨
미네랄 오일	피셔 과학	BP2629 - 1	상공 회의소 조립
현미경 커버 유리	피셔 과학	12-544 - G	상공 회의소 조립
PE α - 인간 CD11a 클론 HI 111	eBioscience	12-0119-71	Fig.1을위한 시약
PE 안티 인간 CD54	eBioscience	12-0549	Fig.1을위한 시약
마우스 IgG1 Isotype 제어 PE	eBioscience	12-4714	Fig.1을위한 시약
유압 micromanipulator	Narishige	MO - 303	Micropipette 시스템
기계 조작하는 사람	뉴 포트	461 - XYZ - M, SM - 13, DM - 13	Micropipette 시스템
압전 번역	Physik Instrumente	P - 840	Micropipette 시스템
LabVIEW	내쇼날 인 스트 루먼트	버전 8.6	Micropipette 시스템
DAQ 보드	내쇼날 인 스트 루먼트	USB - 6008	Micropipette 시스템
광학 테이블	동력학 시스템	5200 시리즈	Micropipette 시스템