תדירות הדבקה Assay עבור באתרו קינטיקס ניתוח חוצה Junctional אינטראקציות מולקולריות על ממשק Cell-Cell

Summary

תדירות הדבקה assay למדידת קולטן ליגנד קינטיקה אינטראקציה כאשר הן מולקולות מעוגנים על פני השטח של התאים אינטראקציה מתוארת. Assay זה מכני מבוסס מודגמת באמצעות micropipette-בלחץ דם אנושי תא אדום כמו חיישן הידבקות integrin αLβ2 ו מולקולה-1 הדבקה אינטר כמו אינטראקציה קולטנים ligands.

Abstract

Assay הידבקות micropipette פותחה בשנת 1998 על מנת למדוד דו ממדי (2D) קולטן ליגנד קינטיקה מחייב ^1. Assay משתמשת תא אנושי דם אדומים (RBC) כמו חיישן הידבקות התא הצגת אחד של מולקולות אינטראקציה. היא מעסיקה המיקרומניפולציה להביא את RBC במגע עם תא אחר המבטא את המולקולה אינטראקציה עם אחרים לאזור שבשליטת בדיוק הזמן כדי לאפשר היווצרות הקשר. האירוע הידבקות מזוהה כמו התארכות RBC על משיכת שני תאים בנפרד. על ידי שליטה על צפיפות של ligands משותקת על פני השטח RBC, ההסתברות של הידבקות נשמר בטווח אמצע בין 0 ל -1. ההסתברות הידבקות מוערך של תדירות האירועים הידבקות ברצף מחזורים חוזרים ונשנים ליצור קשר בין שני תאים לזמן קשר נתון. משנים את זמן מגע יוצר עקומת מחייב. התאמת מודל הסתברותי לתגובת קולטן ליגנד קינטיקה ¹ ל מחייבעקומת מחזירה את הזיקה 2D and off-קצב.

Assay יאומת באמצעות אינטראקציות של רצפטורים Fcγ עם IgG Fc ^1-6, selectins עם ligands glycoconjugate ^{6-9, 10-13} integrins עם ligands, homotypical cadherin מחייב ^14, קולטן T התא coreceptor עם פפטיד הגדולות מתחמי histocompatibility ^{15 - 19.}

בשיטה נעשה שימוש כדי לכמת תקנות קינטיקה 2D ידי גורמים biophysical, כגון הממברנה microtopology ^5, קרום עוגן ^2, אוריינטציה מולקולרית באורך ^6, קשיחות המוביל ^9, עקמומיות ^{20, 20} ו - כוח פגיעה, כמו גם גורמים ביוכימיים, כגון מאפננים של microenvironment cytoskeleton ואת הקרום שבו מולקולות אינטראקציה מתגוררים וארגון פני השטח של המולקולות הללו ^15,17,19.

השיטה גם שימש to המחקר מחייב במקביל של קולטן ליגנד מינים כפול ^3,4, ואת האינטראקציות trimolecular ¹⁹ באמצעות מודל שונה ^21.

היתרון העיקרי של השיטה הוא שהיא מאפשרת מחקר של קולטני בסביבת קרום האם שלהם. התוצאות יכול להיות מאוד שונים מאלו שהושגו באמצעות קולטנים מטוהרים ^17. זה גם מאפשר לימוד של קולטן ליגנד אינטראקציות זמנים המשנה השני עם רזולוציה הזמני הרבה מעבר שיטות ביוכימיות טיפוסיות.

כדי להמחיש את שיטת הדבקה micropipette תדר, אנו מראים מדידה קינטיקה של מולקולת הדבקה אינטר 1 (ICAM-1) על פונקציונליות RBCs מחייב β integrin _L α ₂ על נויטרופילים עם dimeric E-selectin בפתרון להפעיל α β _{L 2.}

Protocol

1. RBCs בידוד מהדם כולו

1. הכן EAS-45 פתרונות. לשקול את כל המרכיבים של טבלה ואני להמיס 100-200 מ"ל מים DI. מוסיפים מים כדי להפוך פתרון 1000ml ולהתאים את ה-pH 8.0. סינון aliquot על ידי 50 מ"ל. הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון.

הערה: שלב 1.2 צריכה להתבצע על ידי הכשרה מקצועית כגון רפואי כאחות, עם ראשי סקירה מוסדיים פרוטוקול שאושר.

2. צייר 3-5 מ"ל של דם מהעו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כדי להשתמש בהצלחה את הידבקות micropipette תדירות assay אחד צריך לשקול צעדים קריטיים מספר. ראשית, ודא כדי להקליט את האינטראקציה ספציפי למערכת קולטן ליגנד של עניין. מדידות בקרה ספציפי (ראה איור. 3, 4) להבטיח את הספציפיות. באופן אידיאלי, הסתברויות הדבקה ספציפי צריך להיות מתחת 0.05 עב.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	קטלוג #	תגובות
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	מדולל עם מים כדי 1x deionized לפני השימוש
Vacutainer EDTA	BD	366643	RBCs בידוד
10 מ"ל PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	RBCs בידוד
אדנין	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 הכנה
D-גלוקוז (דקסטרוז)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 הכנה
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 הכנה
נתרן כלוריד (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 הכנה
פוספט נתרן, Dibasic (Na & # x2082; HPO ₄)	פישר סיינטיפיק	S374	EAS-45 הכנה
L-גלוטמין	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 הכנה
ביוטין-X-NHS	Calbiochem	203188	RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF)	Thermo Scientific	20673	RBCs biotinylation
Borate חוצץ (0.1M)	מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים	11455-90	RBCs biotinylation
Streptavidin	Thermo Scientific	21125	ליגנד functionalizing
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	ליגנד functionalizing
Quantibrite PE חרוזים	BD Biosciences	340495	צפיפות כימות
תזרים cytometer	BD Immunocytometry מערכות	BD LSR II	צפיפות קוואןtification
נימי Tube 0.7-1.0mm x 30 "	קימבל זכוכית בע"מ	46485-1	Micropipette משיכת
שמן מינרלי	פישר סיינטיפיק	BP2629-1	לשכת הרכבה
כיסוי זכוכית מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12-544-G	לשכת הרכבה
Α-PE אדם CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	מגיב על תמונה 1
PE אנטי אנושי CD54	eBioscience	12-0549	מגיב על תמונה 1
עכבר IgG1 אלוטיפ בקרה PE	eBioscience	12-4714	מגיב על תמונה 1
הידראולי micromanipulator	Narishige	MO-303	Micropipette מערכת
מכונות מניפולטור	ניופורט	461-xyz-מ ', SM-13, DM-13	Micropipette מערכת
פיזואלקטריים המתרגם	פיזיק Instrumente	P-840	Micropipette מערכת
LabVIEW	National Instruments	גרסה 8.6	Micropipette מערכת
לוח DAQ	National Instruments	USB-6008	Micropipette מערכת
אופטי שולחן	קינטיקס מערכות	5200 Series	Micropipette מערכת