Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

Riepilogo

Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Abstract

Il test di adesione micropipetta è stato sviluppato nel 1998 per misurare bidimensionali (2D), recettore-ligando cinetica di legame ^1. Il test utilizza un globulo rosso umano (RBC) come sensore di adesione e delle cellule che si presentano per una delle molecole interagenti. Impiega micromanipolazione per portare il RBC in contatto con un'altra cellula che esprime l'altra molecola che interagisce con zona controllata con precisione e tempo per consentire la formazione di legame. L'evento viene rilevato come l'adesione allungamento RBC su tirando le due celle di distanza. Controllando la densità dei ligandi immobilizzato sulla superficie dei globuli rossi, la probabilità di adesione è tenuto in mid-range compreso tra 0 e 1. La probabilità di adesione è stimata dalla frequenza di eventi adesione in una sequenza di cicli ripetuti contatti tra le due cellule per un dato tempo di contatto. Variando il tempo di contatto genera una curva vincolante. Montaggio di un modello probabilistico per recettore-ligando cinetica di reazione ¹ al legamecurva restituisce l'affinità 2D e off-rate.

Il test è stato validato mediante interazioni dei recettori Fcy con IgG Fc ^1-6, selectine con leganti glicoconiugato ^6-9, integrine con leganti ^10-13, homotypical vincolante caderina ^14, recettore delle cellule T e corecettore con peptide-grandi complessi di istocompatibilità ^{15 - 19.}

Il metodo è stato utilizzato per quantificare regolamenti della cinetica 2D da fattori biofisici, come ad esempio la membrana microtopology ^5, della membrana di ancoraggio ^2, orientamento molecolare e lunghezza ^6, rigidità vettore ^9, curvatura ^20, e la forza impingement ^20, così come i fattori biochimici, come modulatori del microambiente citoscheletro e membrana in cui le molecole interagiscono risiedono e l'organizzazione della superficie di queste molecole ^15,17,19.

Il metodo è stato utilizzato anche to studiare il legame simultaneo di doppio recettore-ligando specie ^3,4, e le interazioni trimolecular ¹⁹ con un modello modificato ^21.

Il principale vantaggio del metodo è che permette lo studio dei recettori di membrana nel loro ambiente nativo. I risultati potrebbero essere molto diversi da quelli ottenuti con recettori purificati ^17. Consente inoltre lo studio del recettore-ligando interazioni in un lasso di tempo inferiori al secondo con risoluzione temporale ben oltre i tipici metodi biochimici.

Per illustrare l'adesione metodo micropipetta frequenza, ci mostrano la misurazione cinetica della molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) funzionalizzati su globuli rossi legame β integrina α _{L 2} sui neutrofili con dimerica E-selectina nella soluzione per attivare α β _{L 2.}

Protocollo

1. Isolamento globuli rossi del sangue intero

1. Preparare EAS-45 soluzioni. Pesare tutti gli ingredienti dalla tabella I e sciogliere in 100-200ml di acqua deionizzata. Aggiungere acqua per rendere la soluzione 1000ml e aggiustare il pH a 8,0. Filtro e aliquota da 50ml. Congelare a -20 ° C per la conservazione.

Nota: Passo 1,2 dovrebbe essere eseguita da un medico addestrato ad esempio come infermiera, con un Institutional Review Board protocollo approvato.

2. Disegna 3-5ml di sangue dalla vena cubitale mediana in una provetta da 10 ml contenente EDTA e delicatamente mescolare il sangue con EDTA immediatamente e accuratamente per evitare la coagulazione.
3. Processo di campione di sangue appena possibile. Tutti i passi seguenti, tranne centrifugazione deve essere effettuato sotto il cofano per mantenere la preparazione sterile. Trasferire il sangue in una provetta da centrifuga da 50 ml, aggiungere 10 ml di HISTOPAQUE freddo e sterile 1077 e centrifugare per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Ripetere due volte.
4. Aggiungere 10ml freddo e sterile PBS, centrifugare per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Rimuovere il surnatante. Ripetere 4 volte (totale di 5 volte).
5. Lavare con sterili EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) due volte. Negli ultimi globuli rossi spostare il lavaggio in una nuova provetta sterile 15ml.
6. Risospendere globuli rossi EAS-45 in10ml.

2. RBC biotinilazione

1. Prendete il tubo con globuli rossi dal punto 1. Rimuovere tutti i surnatante dopo centrifugazione per 5 min @ 1000rpm, 4 ° C. Mettere 10μl di GR pellet a ciascuno di fiale diverse e aggiungere corrispondente quantità di soluzione salina in ogni flaconcino (vedere tabella II, ad esempio di preparazione di sei differenti concentrazioni biotinilazione globuli rossi).
2. Fai fresca Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 diluizioni secondo la Tabella II.
3. Aggiungere 10μl di tampone borato 0.1M a ogni flacone.
4. Aggiungi quantità calcolata di biotina soluzione ad ogni flacone (vedi Tabella II come esempio) e vortice immediatamente.
5. Luogo ogni flacone RBCall'interno di un tubo da 50 ml conica e incubare in rotatori per 30 min a temperatura ambiente.
6. Lavare ogni flaconcino 3 volte con 800μl di EAS-45 per 2min @ 2000rpm.
7. Aggiungere 100μl di EAS-45 per ogni flacone e conservare a 4 ° C. In ogni 1ml della soluzione finale, ora dovrebbe essere ~ 1mln di globuli rossi.

3. Funzionalizzazione della biotina-linked * ligandi su globuli rossi

1. Preparare 2mg/ml soluzione streptavidina secondo le istruzioni del produttore. Soluzione Aliqouted possono essere conservati a -20 ° C.
2. Mescolare una pari quantità di globuli rossi a partire dal punto 2.7 (10μl) con la soluzione streptavidina, vortice immediatamente e incubare in rotatori per 30min a 4 ° C.
3. Lavare 3 volte con 500μl di EAS-45 per 2min @ 2000rpm. Aggiungi EAS-45 15μl / 1% BSA per la conservazione.
4. Mix pari quantità di globuli rossi a partire dal punto 3.3 (10μl) con la soluzione legante 20μg/ml, vortice immediatamente e incubare in rotatori per 30 min a temperatura ambiente.
5. Lavare due volte con 500μl di EAS-45 / 1% di BSA per 2min @ 2000rpm. Aggiungere 15μl di EAS-45 / 1% di BSA per la conservazione.

* Se la vostra proteina non ha alcun legame biotina è possibile utilizzare uno dei kit disponibili in commercio per biotinilazione proteine ​​(per esempio, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-biotinilazione Kit) o ​​utilizzare biotinilato anticorpi di cattura come un passo intermedio, come mostrato nel video.

4. Quantificazione delle densità del recettore e ligando

1. Incubare ligando rivestite globuli rossi dal punto 3 e, in un altro flacone, recettore-cuscinetto cellule con concentrazioni di anticorpi monoclonali rispettivi saturando per 30 min a temperatura ambiente. Incubare a separare le cellule flaconcini con irrilevanti isotipo-abbinato anticorpi per il controllo. Se gli anticorpi primari non sono fluorescente, incubare con anticorpi secondari coniugati con fluorescenza in base alle istruzioni del produttore.
2. Analizzare i campioni preparati al punto 4.1 per cytometery flusso con corrispondente fluorescenti calcalibrazione di perline. Calcolare la densità come mostrato in fig. 1.

5. Preparazione per micropipetta e della camera di cellulari

1. Tirare micropipette da tubi capillari utilizzando PN-30 Magnetic Narishige 'Puller microelettrodo orizzontale di vetro o Sutter Instruments Micropipetta Puller.
2. Usa micromanipolatore con microforge per regolare la punta della micropipetta tirato ad una dimensione desiderata (di solito gli intervalli di diametro richiesto dal 1-5 micron a seconda delle dimensioni delle cellule da utilizzare nello studio).
3. Preparare la camera cellula tagliando copertura in vetro Microscopio alle dimensioni desiderate. Tenuta la camera con l'olio minerale da entrambi i lati per evitare l'evaporazione medio di cambiare l'osmolarità durante l'esperimento.
4. Aggiungere le cellule recettore e ligando-cuscinetto alla camera.

6. Micropipetta adesione saggio di frequenza

1. Aspirare le cellule interagiscono con pipette rispettivi e uso del computer programmati piezoelectr traduttore ic a guidare l'RBC dentro e fuori del contatto con la cellula altro con superficie di contatto controllata e tempo. Rilevare eventi adesione osservando allungamento RBC sulla separazione delle cellule.
2. Ripetere il contatto-ritiro ciclo 50-100 volte per un dato tempo di contatto. Registrare gli eventi osservati adesione con l'aggiunta di "1" per l'adesione o "0" per l'adesione in una colonna del foglio di calcolo Excel. È possibile utilizzare un dispositivo di registrazione, ad esempio, media digitali o videocassetta, per le immagini microscopiche.
3. Registrare la frequenza di adesione in funzione del tempo di contatto della curva utilizzando almeno tre coppie di cellule diverse per ogni tempo di contatto per ottenere una media e SEM.
4. Registrare la curva non specifico per il controllo tramite globuli rossi rivestiti con leganti irrilevanti (ad esempio BSA) e / o il blocco dei ligandi o recettori utilizzando i loro anticorpi monoclonali specifici blocco funzionale. Frequenza di adesione specifiche in ogni punto il tempo di contatto può essere calcolato con la rimozione della frequenza di adesione aspecifica ^1.

ove_title "> 7. Analisi dei dati

1. Montare la frequenza specifica adesione P _uno contro dati di contatto tempo t da un modello probabilistico (Equazione 1) che descrive un secondo ordine in avanti e di primo ordine inverso in un unico passaggio interazione tra una singola specie di recettori e una singola specie di ligandi ¹ :
   
   dove K _a è la 2D affinità efficacia vincolante, k _fuori è la off-rate, m _r e m _l sono rispettivamente il recettore e ligando densità misurata al punto 4, e A _c è l'area di contatto. La curva-fit ha due parametri, A _c K _a e k _off, come A _c e K _a sono ammassati insieme e chiamato collettivamente come efficace affinità 2D. Il suo prodotto con la bassa velocità è l'effettivo 2D-rate: una _c = k _su A _c K _una k x _off.
   La specifica adesione frequenza P _a è calcolato per differenza della frazione adesione aspecifica (P _aspecifico) dalla totale adesione misurata (P _misurata) ^1,21:
   

8. Rappresentante dei risultati:

Figura 1 Determinazione del β integrina α _{L 2} densità sito sui neutrofili. I neutrofili sono stati incubati con 1μg/ml di E-selectina-Ig per 10 minuti in modo che corrisponda alla condizione sperimentale utilizzato nelle figure 3,4 o senza E-selectina-Ig, e poi con le concentrazioni di saturazione (10μg/ml) PE-coniugato contro -CD11a umano monoclonale (clone HI111, vedi Tabella di specifichereagenti e attrezzature) o il mouse IgG1 irrilevante per il controllo, lavato, e analizzati immediatamente. I campioni sono stati continua a leggere BD citometro a flusso LSR con lo standard QuantiBRITE gocce di taratura PE. Pannello A mostra istogrammi di fluorescenza di perline di calibrazione (rosa) insieme a quelli di cellule trattate (colore blu) o non trattati E-selectina-Ig (colore verde). Specifiche CD11a colorazione mAb è mostrato in curva solida e irrilevante isotipo-matched colorazione anticorpo di controllo è mostrato in curva tratteggiata. Cellule trattate con E-selectina-Ig (presenza in tutte le fasi di lavaggio e nel tampone FACS) non ha influenzato la densità CD11a come si vede dal confronto con cellule non trattate. Pannello B mostra il processo di quantificazione densità. Log10 è stato calcolato per l'intensità media fluorescente (FI) di ogni valore di picco di istogrammi di calibrazione quattro perle dal Pannello di A (cerchi rosa) e per il lotto-specifici per molecole di PE tallone (dal produttore). Una regressione lineare di molecole Log10 PE per tallone contro Log10 fluorescriferimento è stata tracciata. Per le cellule trattate E-selectina il Log10 FI (y) i valori pari 3,99 (blu cerchio pieno) e 2.23 (blu cerchio aperto) per specifici mAb e anticorpo di controllo, respectivly. Abbiamo risolto l'equazione lineare per x (i valori sono rappresentati come cerchi verdi e blu sul pannello B) x = Log10 PE / cellulare e, come PE:. MAb rapporto era 1:1, il numero totale di β α _{L 2} sui neutrofili è stata calcolato come 9587. Densità superficiale è stata calcolata da 43 molecole / ² micron, utilizzando 8.4μm come il diametro dei neutrofili ^22. Densità di ICAM-1 è stata misurata analogamente da cytometery flusso utilizzando PE-anti-CD54 mAb umano, che è pari al 65 mol / micron ^2.

Figura 2 Micropipetta sistema schemi. Il nostro sistema micropipetta è stato assemblato in casa e si compone di tre sottosistemi: un sottosistema di imaging per consentire di osservare, record e analizzare i movimenti della micropipetta aspirato di cellule, un sottosistema di micromanipolazione permettono di selezionare le celle dalla camera di cella, e un sottosistema di pressione permettono di aspirare le cellule in micropipette. Il pezzo centrale del sottosistema di imaging viene invertito microscopio (Olympus IMT-2 IMT2) con un 100x immersione in olio NA obiettivo 1,25. L'immagine viene inviata a un videoregistratore attraverso un dispositivo coppia carica (CCD) della fotocamera. Un timer video è abbinato al sistema per tenere traccia del tempo. Ogni micropipetta può essere manipolato da una trasmissione meccanica montata sul microscopio e finemente posizionato con un tre assi micromanipolatore idraulico. Manipolatori meccanici da Newport potrebbe essere utilizzato come bene. Uno dei titolari micropipetta è montato su un traduttore piezoelettrico, il conducente del quale è controllato da un computer di LabView codice (disponibile su richiesta) e si traduce segnale attraverso una scheda DAQ attraverso un amplificatore di tensione (in casa) per l'attuatore piezoelettrico. Questo è unllows uno per spostare la pipetta maniera precisa e ripetibile in un ciclo di test di adesione. Il sottosistema di regolazione della pressione viene utilizzato per controllare di aspirazione durante l'esperimento. Una linea idraulica collega il titolare micropipetta ad un serbatoio del liquido. Un posizionatore multa meccanico permette l'altezza del serbatoio in modo preciso manipolato.

Micropipette vengono generati utilizzando KIMAX punto di fusione tubi in vetro borosilicato capillari (con diametro esterno di 1,0 ± 0,07 mm e un diametro interno di 0,7 ± 0,07 mm. In primo luogo, il micropipette da tubi capillari sono tirati con PN-30 Magnetic Narishige 'Puller microelettrodo orizzontale di vetro (Sutter Instruments Micropipetta Puller è un'altra opzione estrattore). In secondo luogo, il sistema Microforge (costruita in casa) è usato per tagliare il micropipette di apertura dimensione desiderata. modelli commerciali di sistemi di Microforge sono disponibili pure.

Per evitare vibrazioni della micropipette durante l'esperimento, il microscOPE, insieme al micromanipolatori, è posto su un tavolo sospensioni pneumatiche.

Figura 3 Esecuzione di frequenza F adesione per _i specifici (A) e aspecifici (B) vincolanti a 1s (rosso) e 10s (blu), tempi di contatto misurato da cicli ripetuti test di aderenza tra RBC rivestito con ICAM-1 (A) o Higg (B ) con neutrofili umani che esprimono integrina α β _{L 2.} F _i = (X ₁ + X ₂ + ... + X _i) / i (1 ≤ i ≤ n), dove i è l'indice ciclo di prova, X _{i è} uguale a "1" (adesione) o "0" (non adesione). F _n (n = 50) è stata utilizzata come la migliore stima per la probabilità di adesione.

Figura 4 Cinetica diICAM-1 legame neutrofili β integrina α _{L 2} ( ). Probabilità adesione misurata come indicato nella figura 3, per tre coppie di cellule in ogni tempo di contatto è media e funzione del tempo di contatto. Il mezzo è stato HBSS camera con 1 mM ciascuno di Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +,} più 1μg/ml dimerica di E-selectina-Ig di upregulate β _L α ₂ vincolanti. Per catturare ICAM-1-Ig di globuli rossi, un passaggio intermedio è stato aggiunto al incubare globuli rossi con anticorpo di cattura 10μg/ml (biotinilato di capra anti-umano degli anticorpi Fc, eBioscience) dopo la fase di incubazione streptavidina. Per controllare per non specifico vincolante due condizioni differenti sono stati utilizzati: 1) globuli rossi rivestiti con l'anti-umano-Fc anticorpo di cattura e incubate con IgG umane invece di ICAM-1-Ig (O) e 2) neutrofili legame con i globuli rossi non rivestito con la la cattura degli anticorpi (Δ). 10μg/ml IgG è stato aggiunto al mezzo per ridurre al minimo vincolante di E-Selectina-Ig in soluzione al anticorpo di cattura sulla superficie dei globuli rossi. Legame aspecifico registrato come curva di IgG umane di controllo è stato utilizzato per ottenere una specifica curva di probabilità di adesione ( ) Con Eq. 2. Adattamento specifico probabilità curva dell'aderenza con l'eq. 1 (linea continua) ha restituito efficace affinità di legame A _c K _a = 1,4 • 10 ^-4 μm4 e k _off = 0,3 s ^-1.

Reagente	MW (g / mol)	Concentrazione (mM)	Importo (g)
Adenina	135,13	2	0,27
D-glucosio (destrosio)	180,16	110	19,82
D-mannitolo	182,17	55	10,02
Cloruro di sodio (NaCl)	58,44	50	2,92
Fosfato di sodio, bibasico (Na HPO )	141,95	20	2,84
L-glutammina	146,15	10	1,46

Tabella 1. Preparazione EAS-45 buffer (1L).

25 mg biotina-XHS in 550 ml di DMF	0,1 M soluzione biotina
Diluizione 1:10 di 0,1 biotina w / DMF	0.01M biotina soluzione
Diluizione 1:100 di 0,1 biotina w / DMF	0.001M biotina soluzione

Tabella 2. Preparazione della soluzione di biotina.

biotina concentrazione finale (mM)	4	10	20	50	100	160
RBC pellet magazzino (microlitri)	10	10	10	10	10	10
1x PBS (microlitri)	179,2	178	176	179	178	176,8
Borato 0.1M tampone (microlitri)	10	10	10	10	10	10
0.01M biotina soluzione (microlitri)				1	2	3,2
0.001M biotina soluzione (microlitri)	0,8	2	4

Tabella 3. Biotinilazione di globuli rossi.

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Discussione

Per utilizzare con successo l'adesione saggio micropipetta frequenza si dovrebbe considerare diversi passaggi critici. Per prima cosa, assicurarsi di registrare l'interazione specifica per il recettore-ligando sistema di interesse. Misure di controllo non specifici (cfr. fig. 3, 4) garantire la specificità. Idealmente, le probabilità di adesione non specifica deve essere inferiore a 0,05 per durate di tempo tutti i contatti e di avere una significativa differenza tra le probabilità di adesione specifici e non...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Catalogo #	Commenti
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Diluire a 1x con acqua deionizzata prima dell'uso
Vacutainer EDTA	BD	366643	RBC isolamento
10ML PK100
HISTOPAQUE 1077	Sigma-Aldrich	10771	RBC isolamento
Adenina	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 preparazione
D-glucosio (destrosio)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 preparazione
D-mannitolo	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 preparazione
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 preparazione
Fosfato di sodio, bibasico (Na & # x2082; HPO ₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 preparazione
L-glutammina	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 preparazione
Biotina-X-NHS	Calbiochem	203188	RBC biotinilazione
Dimetilformammide (DMF)	Thermo Scientific	20673	RBC biotinilazione
Borato Buffer (0,1 M)	Electron Microscopy Sciences	11455-90	RBC biotinilazione
Streptavidina	Thermo Scientific	21125	Ligand funzionalizzazione
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand funzionalizzazione
Quantibrite PE Perline	BD Biosciences	340495	Densità di quantificazione
Citometro a flusso	BD Immunocytometry Sistemi	BD LSR II	Densità di quanidentificazione
Tubo capillare 0,7-1.0mm x 30 "	Kimble Glass Inc.	46485-1	Micropipetta tirando
Olio minerale	Fisher Scientific	BP2629-1	Camera di montaggio
Microscopio copertura in vetro	Fisher Scientific	12-544-G	Camera di montaggio
PE-α umano CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	Reagente per Fig.1
PE anti-CD54 umano	eBioscience	12-0549	Reagente per Fig.1
IgG1 Isotipo controllo PE	eBioscience	12-4714	Reagente per Fig.1
micromanipolatore idraulico	Narishige	MO-303	Micropipetta sistema
Manipolatore meccanico	Newport	461-xyz-m, SM-13, DM-13	Micropipetta sistema
traduttore piezoelettrico	Physik Instrumente	P-840	Micropipetta sistema
LabVIEW	National Instruments	Versione 8.6	Micropipetta sistema
Scheda DAQ	National Instruments	USB-6008	Micropipetta sistema
Tavolo ottico	Cinetica Sistemi	Serie 5200	Micropipetta sistema