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Aquí se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro.
El objetivo de la fijación es preservar rápida y uniformemente tejido en un estado de vida similar. Mientras que la colocación de tejido directamente en obras fijador bien para pequeños trozos de tejido, los especímenes más grandes como el cerebro intacto plantean un problema para la fijación de inmersión porque el fijador no llega a todas las regiones del tejido a la misma velocidad 5,7. A menudo, los cambios en respuesta a la hipoxia comenzar antes de que el tejido se puede conservar 12. La ventaja de la fijación directa perfusión a través del sistema circulatorio es que el producto químico puede llegar rápidamente a todos los rincones del organismo a través de la red vascular natural. A fin de utilizar el sistema circulatorio más eficaz, se debe tener cuidado para que coincida con presiones fisiológicas 3. Es importante señalar que las presiones fisiológicas son dependientes de la especie utilizada. Las técnicas para la fijación de perfusión varían en función del tejido a ser fijado y cómo el tejido será procesado posterior a la fijación. En este vídeo, Se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro para inmunohistoquímica. La principal ventaja de esta técnica (vs alimentada por gravedad sistemas) es que el sistema circulatorio se utiliza más eficazmente.
1. Preparar Fijador
(Ver tabla de fijador y tampones.)
2. Preparar los búferes de perfusión
(Ver tabla de fijador y tampones.)
3. Preparar Aparatos y Anestesia
4. Perfusión Cirugía
Haga clic aquí para ver más grande la figura .
5. Perfusión
6. Disección de 4,11
7. Posterior a la fijación y almacenamiento
8. Los resultados representativos
Un primer indicador del éxito de la perfusión es la limpieza de las extremidades, tales como la nariz, orejas y patas y los órganos internos tales como la glándula del timo y el hígado (IHC Mundial).Inspección macroscópica del cerebro revela el vacío vaso sanguíneo de la sangre (de color blanco a la apariencia de color amarillo pálido). Esto será cierto también en secciones de tejido destinar para la tinción e inmunohistoquímica. El indicador final de los resultados de la perfusión es la condición de la ultraestructura en el tejido. 1,6,7,8
Preparar Fijador: |
Preparar un 8% de valores paraformaldehído |
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Preparar 0,2 M tampón fosfato de sodio, pH 7,4 |
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Preparar un 4% paraformaldehído fijador |
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Preparar la perfusión y tampones de almacenamiento: |
Preparar tampón fosfato salino pH, 7,4 |
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HEPES buffer Hanks solución (HBHS) con un pH de 7,4 Azida sódica |
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Tabla 1. Preparación del fijador y tampones.
Figura 1. aparato de perfusión con componentes etiquetados.
Figura 2. Preparación de la perfusión Aparato I. Comienza con la línea de fijador. Lavar el tubo de burbujas de aire y llenar con tampón por rápidamente expulsar o retirar el tampón en la jeringa ya través de la línea. Cerrar la válvula en el extremo de la aguja fuera. Coloque la línea de fijador en la botella de fijador sin introducir burbujas de aire.
Figura 3. Preparación de la perfusión Aparato II. 1. Abrir la válvula en el extremo de la aguja. 2. Gire la válvula de amortiguación (azul) en la posición de flujo. 3. Lavar el tubo de burbujas de aire y llenar con tampón por rápidamente expulsar o retirar el tampón con la jeringa. 4. Cerrar la válvula en el extremo de la aguja. Coloque el tubo en la botella de amortiguación. Presión de prueba para asegurarse de que el sistema está sellado correctomente por el bombeo de la bombilla manómetro y observa el manómetro. El aparato está ahora listo para el procedimiento de perfusión.
Figura 4. Aparato de perfusión en la posición para la entrega de amortiguación.
Figura 5. Perfusión Cirugía I. a) Haga una incisión lateral a través del tegumento y la pared abdominal. b) Hacer una incisión en el diafragma y cortar a través del diafragma exponer el corazón. Hacer cortes paralelos a cada lado de las costillas hasta la clavícula. c) sujetar la punta del esternón con la pinza hemostática y colocar la pinza hemostática sobre la cabeza.
Figura 6. Perfusión Cirugía II. a) Se pasa la aguja de perfusión a través del ventrículo corte en la aorta ascendente. b) Fijar ella aguja de perfusión uso de un conjunto de pinzas hemostáticas para poner freno al corazón. Un segundo conjunto de una pinza hemostática modificada también se puede utilizar para sujetar la aorta alrededor de la punta de la aguja para evita la fuga. Con unas tijeras iris hará una pequeña incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo.
Figura 7. Perfusión con bomba en el búfer de la bombilla de manómetro para crear presión en la línea. Abra la válvula (1) y conectar a la base de la aguja. Es fundamental asegurarse de que no queden burbujas de aire introducido. Sube el bulbo manómetro a una presión de 80 mm Hg y mantener esta presión durante todo el período de infusión tampón.
Figura 8. De perfusión con tampón de Fijación vez está casi terminado (200 ml) conmutar la válvula de tampón (1) para permitir la fijación al flujo. La presión se puede aumentar gradualmente hasta unmáximo de 130 mm de Hg.
I. En la figura 9. La disección a) quitar de la cabeza con un par de tijeras. b) hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea media desde el cuello hasta la nariz y exponer el cráneo. c) cortar el músculo del cuello restante de modo que la base del cráneo está expuesto. Sostenga la cabeza de modo que la gran abertura en la superficie del cráneo (foramen magnum) es accesible. Con cuidado, inserte la punta de unas tijeras iris en el foramen magnum y haga un corte. Repita la misma maniobra en el lado contralateral. Utilice las gubias para despejar el cráneo por el cerebelo.
Figura 10. Disección II. a) deslice cuidadosamente las tijeras a lo largo de la superficie interna del cráneo. Levante la punta a medida que se corte para evitar daños en el cerebro. Repita el mismo paralado opuesto. Utilizar gubias pelar el cráneo fuera del cerebro. b) ilustración con el cráneo removido y expuesto el cerebro. c) utilizar una espátula para cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas en la zona más anterior del cerebro. Guíe con cuidado la punta de la espátula a lo largo de la parte inferior del cerebro para separar las conexiones para facilitar su eliminación. Retire el cerebro y lo coloca en un vial de fijador.
Notas adicionales para una operación exitosa:
Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo fue financiado por el Centro de Tecnología de Comunicación Neural (CNCT), un Centro de Recursos P41 financiado por el Instituto Nacional de Bioingeniería e Imágenes Biomédicas (NIBIB, P41 EB002030) y apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
Anestésico: | |||
La ketamina / xilazina mezcla (Anestesia pueden variar según el laboratorio / institución) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 ml frasco |
Cirugía: | |||
Punta de la aguja, 27 x 1,25 GA " | Servicios de material | 25251 | |
Grandes romas / romas tijeras curvas (aproximadamente 14,5 cm) | Herramientas de Bellas Ciencia | 14519-14 | |
Recta tijeras iris | Herramientas de Bellas Ciencia | 14058-11 | |
Norma pinzas | Herramientas de Bellas Ciencia | 11027-12 | |
Par de fino (Graefe) pinzas | Herramientas de Bellas Ciencia | 11050-10 | |
1 pinza hemostática grandes - curvas o rectas (~ 19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
2 pinzas de hemostato estándar - recta dentada (14 cm) | Herramientas de Bellas Ciencia | 13013-14 | |
Una pinza hemostática modificada (con orificio de calibre 15 presentada por la punta) | Herramientas de Bellas Ciencia | 13013-14 | |
15-calibre de la aguja con punta roma o de oliva-(aguja de perfusión) | Fisnar | 5601137 | |
Perfusión: | |||
HyPerfusion sistema o equivalente | |||
Tamponada con fosfato salino pH, 7,4 | |||
Paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4 | |||
De vidrio poco profundo o una bandeja de plástico, de aproximadamente 10 "x 10" | |||
Hielo picado | |||
Baño de agua (37 ° C) | |||
Temporizador | |||
50 ml de jeringa | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
La disección: | |||
Pensilvaniair de la norma tijeras rectas, rectas / romas (~ 12 cm) | Herramientas de Bellas Ciencia | 14054-13 | |
Medio gubias curvas o rectas (14-16 cm) o pinzas de hueso del cráneo de eliminación | Herramientas de Bellas Ciencia | 16020-14 | |
Recta tijeras iris (~ 9 cm) | Herramientas de Bellas Ciencia | 14058-11 | |
Micro-espátula (2 dobles "extremos planos, uno redondeado, cónico uno a 1/8") | Herramientas de Bellas Ciencia | 10091-12 | |
Posterior a la fijación y el almacenamiento: | |||
50 ml frasco de vidrio | |||
40 ml de HEPES-Buffered Hanks Solución (HBHS) con azida de sodio (90 mg / l) |
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