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Descrevemos aqui um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro.
O objetivo da fixação é rápida e uniformemente preservar o tecido em um estado de vida semelhante. Embora a colocação do tecido directamente em obras fixadoras bem para pequenos pedaços de tecido, os espécimes maiores, como o cérebro intacto representar um problema para a fixação de imersão porque o fixador não atinge todas as regiões do tecido com a mesma taxa 5,7. Muitas vezes, muda em resposta a hipoxia começar antes do tecido pode ser preservada 12. A vantagem de perfusão fixador diretamente através do sistema circulatório é que a química pode rapidamente chegar a todos os cantos do organismo, utilizando a rede natural vascular. A fim de utilizar o sistema circulatório de forma mais eficaz, deve ser tomado cuidado para coincidir com as pressões fisiológicas 3. É importante notar que as pressões fisiológicas são dependentes das espécies utilizadas. Técnicas para a fixação de perfusão variam, dependendo do tecido a ser fixado e como o tecido será processado fixação seguinte. Neste vídeo, Nós descrevemos um baixo custo, rápida, o procedimento de fixação controlada e uniforme utilizando paraformaldeído a 4% perfundidos através do sistema vascular: através do coração do rato para se obter o melhor possível a preservação do cérebro para imuno-histoquímica. A principal vantagem desta técnica (vs. alimentado pela gravidade sistemas) é que o sistema circulatório é utilizado mais eficazmente.
1. Preparar Fixador
(Veja tabela de Fixação e Buffers.)
2. Prepare Buffers de perfusão
(Veja tabela de Fixação e Buffers.)
3. Prepare Aparelhos e Anestesia
4. Cirurgia de perfusão
Clique aqui para ver maior figura .
5. Perfusão
6. Dissecção 4,11
7. Pós-fixação e armazenamento
8. Os resultados representativos
Um indicador do sucesso inicial da perfusão é a compensação das extremidades, como o nariz, orelhas e patas e órgãos internos, tais como a glândula timo e fígado (IHC Mundial).Inspeção bruta do cérebro revela o vazio vaso sanguíneo do sangue (branco a aparência amarelo-claro). Este será também verdade dentro das seções de tecido destinar para a coloração e imuno-histoquímica. O indicador final do resultado da perfusão é a condição de a ultraestrutura no tecido. 1,6,7,8
Preparar Fixador: |
Prepare estoque paraformaldeído 8% |
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Preparar 0,2 M tampão fosfato de sódio, pH 7,4 |
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Prepare fixadora paraformaldeído 4% |
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Prepare Perfusão e buffers de armazenamento: |
Preparar tampão fosfato, pH 7,4 Solução Salina |
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HEPES Hanks Solution (HBHS) com pH 7,4 Sódio Azida |
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Tabela 1. Preparação de fixador e tampões.
Figura 1. aparelho de perfusão com componentes marcados.
Figura 2. Preparação da perfusão do Aparelho I. Comece com a linha de fixador. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão para a seringa e através da linha. Fechar a válvula na extremidade da agulha fora. Coloque a linha fixador para a garrafa fixador sem a introdução de bolhas de ar.
Figura 3. Preparação da perfusão do Aparelho II. 1. Abrir a válvula na extremidade da agulha. 2. Gire a válvula tampão (azul) para a posição para o fluxo. 3. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão com a seringa. 4. Fechar a válvula na extremidade da agulha. Coloque tubo dentro da garrafa buffer. Pressão de teste para garantir que o sistema é selado corretaly por bombeamento até o bulbo manômetro e observando o medidor. O aparelho está agora pronto para o procedimento de perfusão.
Figura 4. Aparelho de perfusão em posição para entrega tampão.
Figura 5. Perfusão Cirurgia I. a) Faça uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal. b) Fazer uma incisão no diafragma e atravessam o diafragma expor o coração. Fazer cortes paralelos em ambos os lados das costelas até a clavícula. c) fixar a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça.
Figura 6. Perfusion Cirurgia II. a) Passa a agulha de perfusão através do ventrículo corte na aorta ascendente. b) Assegurar operfusão agulha utilização um conjunto de hemostats para reprimir o coração. Um segundo conjunto de uma hemostato modificado pode também ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha para evitar fugas. Utilizando uma tesoura de íris fazer uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo.
Figura 7. Perfusion com bomba tampão a lâmpada manómetro para criar pressão na linha. Abra a válvula (1) e anexar ao cubo da agulha. É fundamental certificar-se há bolhas de ar são introduzidas. Bombear a lâmpada manómetro para uma pressão de 80 mm Hg e manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão.
Figura 8. Perfusion com fixador Uma vez tampão está quase terminada (200 ml) alternar a válvula de tampão (1) para permitir o fixador de fluxo. A pressão pode ser gradualmente aumentada até ummáximo de 130 mm Hg.
Figura 9. I. Dissecção a) retirar a cabeça, usando um par de tesoura. b) fazer uma incisão na pele ao longo da linha média do pescoço para o nariz e expor o crânio. c) aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta. Segure a cabeça para que a grande abertura na superfície do crânio (forame magno) é acessível. Introduza cuidadosamente a ponta afiada de um par de íris tesoura para o forame magno e fazer um corte. Repita a mesma manobra para o lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo.
Figura 10. Dissecção II. a) deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio. Levante a ponta como você está cortando para evitar danos ao cérebro. Repita a mesma paralado oposto. Use fórceps casca do crânio para longe do cérebro. b) ilustração com o crânio removido eo cérebro exposto. c) Utilização de uma espátula para cortar as lâmpadas olfactivas e conexões nervosas no local mais anterior do cérebro. Cuidadosamente orientar a ponta de espátula ao longo do lado de baixo do cérebro para cortar as ligações para a facilidade de remoção. Remover o cérebro e colocá-lo num frasco de fixador.
Notas adicionais para uma cirurgia bem sucedida:
Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi financiado pelo Centro de Tecnologia de Comunicação Neural (CNCT), um Centro de Recursos P41 financiado pelo Instituto Nacional de Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) e apoiado pelo National Institutes of Health (NIH).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipamento | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
Anestesia: | |||
Cetamina / xilazina (mistura anestésica pode variar por laboratório / instituição) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | Frasco 10 ml |
Cirurgia: | |||
Ponta da agulha, 27 GA x 1,25 " | Serviços material | 25251 | |
Grandes Blunt / sem corte tesoura curva (aprox. 14,5 cm) | Belas Ferramentas Ciência | 14519-14 | |
Reta para íris tesoura | Belas Ferramentas Ciência | 14058-11 | |
Standard pinças | Belas Ferramentas Ciência | 11027-12 | |
Par de multa (zu) pinça | Belas Ferramentas Ciência | 11050-10 | |
1 pinça hemostática - grandes curvas ou retas (~ 19 cm) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
2 padrão pinça hemostática - em linha reta serrilhada (14 cm) | Belas Ferramentas Ciência | 13013-14 | |
1 hemostat modificado (com calibre 15 buracos arquivado através da ponta) | Belas Ferramentas Ciência | 13013-14 | |
Calibre 15 com agulha romba ou azeite de ponta (agulha de perfusão) | Fisnar | 5601137 | |
Perfusão: | |||
Sistema de hiperperfusão ou equivalente | |||
Tamponada com fosfato, pH 7,4 salina | |||
Paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 | |||
Copo raso ou bandeja de plástico, cerca de 10 "x 10" | |||
Gelo picado | |||
Banho de água (37 ° C) | |||
Cronômetro | |||
50 ml da seringa | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
Dissection: | |||
Pari do padrão da Sharp / tesoura cega retas (~ 12 cm) | Belas Ferramentas Ciência | 14054-13 | |
Medianas fórceps curvas ou retas (14-16 cm) ou alicates crânio remoção óssea | Belas Ferramentas Ciência | 16020-14 | |
Reta para íris tesoura (~ 9 cm) | Belas Ferramentas Ciência | 14058-11 | |
Micro-espátula (2 duplos "extremidades planas, um arredondado, uma reduzida para 1/8") | Belas Ferramentas Ciência | 10091-12 | |
Pós-fixação e armazenamento: | |||
50 frasco de vidro ml | |||
40 ml de HEPES-Tamponada Hanks Solução (HBHS) com azida de sódio (90mg / l) |
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