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ラットの心臓部を介して脳の最良の保全を取得するには:ここでは、血管系を介して灌流を4%パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。
固定の目的は、急速にかつ均一に生きているような状態で組織を維持することです。固定は、同じレート5,7で組織のすべての領域に到達しないため組織の小さな断片は、無傷の脳の浸漬固定のために問題を引き起こすような大きな試料でも固定の作品に直接組織を配置しながら。組織が 保存される前に、多くの場合、低酸素への応答の変化は、12を開始します 。直接循環系を介して固定液を灌流することの利点は、化学物質がすぐに自然な血管網を用いた生物の隅々に到達することができるということです。最も効果的に循環系を利用するためには、注意が生理的な圧力を3と一致するように注意する必要があります。生理的な圧力が使用される種に依存していることに注意することが重要です。灌流固定するためのテクニックは、固定される組織によって異なり、どのように組織は、次の固定を処理されます。このビデオでラットの心臓を免疫組織化学のための脳の最良の保全を得るために:我々は、血管系を介して灌流を4%パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。この技術の主な利点(対重力給電システム)は、循環器系が最も有効に活用されていることです。
1。固定液を準備する
(テーブルの固定液とバッファを参照してください。)
2。灌流バッファを準備します。
(テーブルの固定液とバッファを参照してください。)
3。装置および麻酔を準備します。
4。血流外科
5。かん流
6。解剖4,11
7。ポスト固定&ストレージ
8。代表的な結果
灌流の成功の最初の指標は、鼻など四肢、耳、足など胸腺および肝臓(IHCワールド)などの内部器官のクリアです。脳の肉眼検査は、血液(淡黄色の外観に白)の血管voidを明らかにする。これは、染色と免疫組織化学のために運命づける組織切片内でもtrueになります。灌流の結果の最終的な指標は、組織内の微細構造の状態である。1,6,7,8
固定液の準備: |
8%のパラホルムアルデヒドの在庫を準備します。 |
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0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4を準備します。 |
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4%パラホルムアルデヒド固定液を準備します。 |
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灌流およびストレージバッファを準備します。 |
リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4のバッファの準備 |
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HEPESは、アジ化ナトリウムpH7.4でハンクス液(HBHS)をバッファ |
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表1固定液とバッファーの調製。
図1。 ラベルコンポーネントと灌流装置。
図2:灌流装置I.の準備は固定行で開始します。気泡のチューブをフラッシュし、急速に注射器にし、ラインを介してバッファを追放し、撤退することで、バッファに記入してください。針側のバルブを遮断してください。気泡を導入することなく、固定瓶に固定行を置きます。
図3:灌流装置IIの調製。 1。針の端にバルブを開きます。 2。フローに配置するバッファバルブ(青)を回します。 3。気泡のチューブをフラッシュし、急速に追放し、シリンジでバッファを引き出すことによってバッファを使用して記入してください。 4。針の端にあるバルブを閉じます。バッファのボトルにチューブを置きます。システムが正しい密封されていることを確認する試験圧力圧力計の電球を汲み上げ、ゲージを見ながらLY。装置は、現在灌流手続きの準備ができています。
図4バッファの配信のための位置に灌流装置。
図5潅流手術I.)は、外皮と腹壁を介して横方向の切開を行います。 b)の横隔膜の切開を行い、心臓を露出させる横隔膜を横切る。アップ鎖骨にリブの両側に平行にカットします。 c)の止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。
図6。灌流手術II。 1)上行大動脈にカット心室を通して灌流針を渡します。 b)に固定灌流針が心臓をクランプするhemostatsのいずれかのセットを使用します。変更された止血剤の2番目のセットはまた、漏れを防止するために針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。アイリスのはさみを使用すると、左心室の後端に小さな切開を行います。
図7。ライン内の圧力を作成するためのバッファポンプ圧力計の電球と灌流。バルブ(1)を開くと、針ハブに接続します。それは空気の泡が導入されていないことを確認することが重要です。 80ミリメートルHgの圧力に圧力計バルブをポンプおよびバッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。
図8。固定液で灌流バッファがほぼ完成されるとは(200ミリリットル)が流れるように固定を可能にするためにバッファバルブ(1)を切り替えます。圧力は徐々にまで増加することができます130ミリメートルHgの最大値。
図9。解剖I.)は、はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。 b)の首から鼻まで正中線に沿って皮膚切開を行い、頭蓋骨を公開します。頭蓋底が露出されるように、c)の残りの首の筋肉を切り落とす。頭蓋表面の大開口部(大後頭孔)がアクセスできるように頭部を保持します。慎重に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い先端を挿入し、切断してください。反対側に同じ操作を繰り返します。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。
図10。解剖II。 1)慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。あなたは脳への損傷を防ぐために切断される先端を持ち上げます。のために同じことを繰り返す反対側。脳から離れ頭蓋骨皮rongeursを使用しています。 b)の頭蓋骨のイラストは削除され、脳が露出した。 c)の脳の最も前方の位置に嗅球神経接続を切断するヘラを使用しています。慎重に削除を容易にするために接続を切断するための脳の下面に沿ってヘラの先端をガイドします。脳を除去し、固定液のバイアルに入れてください。
手術の成功のために追加のメモ:
著者らは、開示することは何もありません。
この作業は神経通信技術センター(CNCT)、生物医学イメージングとバイオの国立研究所(NIBIB、P41 EB002030)によって資金を供給され、国立衛生研究所(NIH)でサポートされているP41リソースセンターによって資金を供給された。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
機器 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
麻酔: | |||
ケタミン/キシラジン混合物(麻酔が研究室/機関ごとに異なる場合があります) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 mLのバイアル |
手術: | |||
針の先端、27 GA×1.25 " | 資材·サービス | 25251 | |
大鈍/鈍湾曲したハサミ(〜14.5センチメートル) | ファイン科学ツール | 14519から14 | |
ストレートアイリスはさみ | ファイン科学ツール | 14058から11 | |
標準ピンセット | ファイン科学ツール | 11027から12 | |
ファイン(グレーフェ)ピンセット | ファイン科学ツール | 11050から10 | |
1つの大きな止血鉗子 - 曲線または直線(〜19センチ) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
2標準止血鉗子 - ストレートセレーション(14センチ) | ファイン科学ツール | 13013から14 | |
1変更された止血剤(チップを介して提出し、15ゲージ穴付) | ファイン科学ツール | 13013から14 | |
15ゲージの鈍またはオリーブ先端が針(灌流針) | Fisnar | 5601137 | |
灌流 : | |||
HyPerfusionシステムまたは同等の | |||
リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4の緩衝 | |||
0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中4%パラホルムアルデヒド | |||
浅いガラスまたはプラスチックトレイ、約10 "×10" | |||
クラッシュアイス | |||
水浴(37℃) | |||
タイマー | |||
50mlの注射器 | MEDLINE産業 | NPMJD50LZ | |
解剖 : | |||
パ標準的な鋭い/鈍いストレートはさみのIR(〜12センチ) | ファイン科学ツール | 14054から13 | |
培地曲線または直線rongeurs(14-16 cm)または頭蓋骨除去ペンチ | ファイン科学ツール | 16020から14 | |
ストレートアイリスはさみ(〜9センチ) | ファイン科学ツール | 14058から11 | |
マイクロスパチュラ(ダブル2 "フラット終了すると、1を丸め、円すい1〜1/8") | ファイン科学ツール | 10091から12 | |
ポスト·ボール&ストレージ: | |||
50 mlのガラスバイアル | |||
アジ化ナトリウム(90mg / l)を40ミリリットルHEPES緩衝ハンクス溶液(HBHS) |
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