Method Article
כאן אנו מתארים בעלות נמוכה, בהליך מהיר, קיבעון מבוקר ואחיד באמצעות paraformaldehyde 4% perfused דרך מערכת כלי הדם: דרך הלב של חולדה כדי לקבל את השמירה הטובה ביותר של המוח.
המטרה של קיבעון היא במהירות אחידה לשמר רקמות במצב כמו חיים. תוך שימת רקמות ישירות בעבודות מקבע היטב חתיכות קטנות של רקמות, דגימות גדולות יותר כמו המוח ללא שינוי מהווה בעיה עבור קיבעון טבילה משום מקבע לא מגיע בכל אזורי הרקמה באותו קצב 5,7. לעתים קרובות, שינויים בתגובה היפוקסיה להתחיל לפני רקמה ניתן לשמר 12. היתרון של המרוססת מקבע ישירות דרך מערכת הדם היא כימית יכול להגיע במהירות לכל פינה של האורגניזם באמצעות רשת כלי דם טבעי. על מנת לנצל את מחזור הדם בצורה היעילה ביותר, יש להקפיד להתאים לחצים פיזיולוגיים 3. חשוב לציין כי לחצים פיזיולוגיים תלויים המינים בשימוש. טכניקות קיבוע זלוף משתנים בהתאם רקמות להיות קבוע וכיצד רקמות יעובדו קיבעון הבאה. זה וידאואנו מתארים בעלות נמוכה, בהליך מהיר, קיבעון מבוקר ואחיד באמצעות paraformaldehyde 4% perfused דרך מערכת כלי הדם: דרך הלב של חולדה כדי לקבל את השמירה הטובה ביותר של המוח עבור אימונוהיסטוכימיה. היתרון העיקרי של שיטה זו (לעומת כוח הכבידה-fed מערכות) היא מערכת הדם הוא מנוצל בצורה היעילה ביותר.
1. הכן מקבע
(ראה מקבע שולחן Buffers).
2. הכן Buffers זלוף
(ראה מקבע שולחן Buffers).
3. להכין מנגנון הרדמה
4. זלוף כירורגיה
לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .
5. זלוף
6. דיסקציה 4,11
7. לאחר קיבוע & Storage
8. נציג תוצאות
מדד הראשוני של ההצלחה של זלוף הוא הסליקה של הגפיים כמו האף, האוזניים, וכפות רגליים ואיברים פנימיים כגון בלוטת התימוס ועל הכבד (IHC העולם).בדיקה גסה של המוח מגלה את חלל כלי הדם של דם (לבן למראה צהוב בהיר). זה יהיה נכון גם בתוך סעיפים רקמות ליעד עבור מכתים ו אימונוהיסטוכימיה. מדד הסופי של תוצאות זלוף הוא מצב ultrastructure ברקמות. 1,6,7,8
הכן מקבע: |
להכין מלאי Paraformaldehyde 8% |
|
להכין 0.2 סודיום פוספט מאגר M, pH 7.4 |
|
הכן מקבע Paraformaldehyde 4% |
|
הכן זלוף ו Buffers אחסון: |
הכן בופר פוספט pH מלוחים, 7.4 |
|
HEPES שנאגרו הנקס פתרון (HBHS) עם pH 7.4 נתרן אזיד |
|
טבלה 1. הכנת מקבע ו Buffers.
באיור 1. Apparatus זלוף עם רכיבים המסומנים.
איור 2. הכנת מנגנון זלוף א בגין עם קו מקבע. שטוף את צינורות של בועות אוויר וממלאים חיץ במהירות על ידי גירוש ונסיגה חיץ לתוך המזרק דרך הקו. לסגור את השסתום בקצה המחט מעל. מניחים את קו מקבע לבקבוק מקבע ללא החדרת בועות אוויר.
איור 3. הכנת מנגנון זלוף השנייה. 1. פתח את השסתום בקצה המחט. 2. הפעל שסתום חיץ (כחול) כדי למקם את הזרימה. 3. שטוף את צינורות של בועות אוויר וממלאים חיץ במהירות על ידי גירוש ונסיגה חיץ עם המזרק. 4. סגור את שסתום בקצה המחט. מניחים צינורות לתוך הבקבוק חיץ. מבחן לחץ על מנת לוודא את מערכת נחרץ הנכוןLY על ידי שאיבה את הנורה מד ומסתכל מד. המכשיר מוכן כעת הליך זלוף.
איור 4. Apparatus זלוף במצב למסירה המאגר.
איור 5. ניתוח זלוף א) לעשות חתך לרוחב דרך integument ואת דופן הבטן. ב) עושים חתך הסרעפת לחצות את הסרעפת חושפים את הלב. לבצע חתכים מקבילים משני צדי הצלעות עד עצם הבריח. ג) להדק את קצה עצם החזה עם hemostat ומניחים hemostat על הראש.
איור 6. ניתוח זלוף השנייה. א) להעביר את המחט דרך זלוף החדר חתך לתוך אבי העורקים העולה. ב) מאובטחמחט זלוף שימוש סט אחד של hemostats כדי לצבוט את הלב. קבוצה שנייה של hemostat שונה יכול לשמש גם כדי לצבוט אבי העורקים סביב קצה המחט מונע דליפה. באמצעות מספריים איריס לעשות חתך קטן לסוף האחורי של החדר השמאלי.
איור 7. זלוף עם משאבה למאגר הנורה מד ליצור לחץ על הקו. פתח את השסתום (1) ולצרף לרכזת את המחט. זה קריטי על מנת לוודא שאין בועות אוויר מוצגים. הגבר את הנורה מד הלחץ ללחץ של 80 מ"מ כספית בלחץ ולשמור על זה לאורך כל תקופת העירוי המאגר.
איור 8. זלוף עם מקבע לאחר חיץ הוא כמעט סיים (200 מ"ל) להחליף שסתום חיץ (1), כדי לאפשר מקבע לזרום. הלחץ יכול להיות גדל בהדרגה עדמרבי של 130 מ"מ כספית.
איור 9. א Dissection) להסיר את הראש בעזרת זוג מספריים. ב) לעשות חתך בעור לאורך קו האמצע של הצוואר אל פנים ולחשוף את הגולגולת. ג) לקצץ את שריר הצוואר הנותרים כך את בסיס הגולגולת חשוף. להחזיק את הראש, כך פתח גדול משטח הגולגולת (foramen magnum) נגיש. בזהירות להכניס את הקצה החד של זוג מספריים איריס אל מגנום foramen ולעשות חתך. חזור על התרגיל אותו לצד הנגדי. השתמש rongeurs לפנות את הגולגולת סביב המוח הקטן.
איור 10. Dissection השנייה. א) בזהירות להחליק את המספריים על פני השטח הפנימי של הגולגולת. להרים על קצה כמו שאתה חותך כדי למנוע נזק למוח. לחזור על אותו הדברבצד הנגדי. השתמש rongeurs קליפת הגולגולת מן המוח. ב) באיור עם הגולגולת שהוסר והמוח חשוף. ג) להשתמש במרית לנתק את נורות חוש הריח וחיבורי העצב במיקום הקדמי ביותר של המוח. בזהירות לכוון את קצה מרית לאורך החלק התחתון של המוח לנתק קשרים על מנת להקל על הסר. הסר את המוח ולמקם אותו בקבוקון של מקבע.
הערות נוספות לניתוח מוצלח:
החוקרים אין לי מה לחשוף.
עבודה זו מומנה על ידי המרכז לטכנולוגיה ותקשורת עצבית (CNCT), מרכז P41 משאבים הממומן על ידי המכון הלאומי ביו הדמיה Bioengineering (NIBIB, P41 EB002030) ונתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ציוד | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
הרדמה: | |||
קטמין / xylazine תערובת (הרדמה יכולה להשתנות לפי המעבדה / מוסד) | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | 10 מ"ל בבקבוקון |
ניתוח: | |||
קצה המחט, GA 27 x 1.25 " | אמצעי שירותים | 25251 | |
גדולים קהים / בוטה מספריים מעוגלות (~~~HEAD=NNS 14.5 ס"מ) | מדע כלים עדינים | 14519-14 | |
ישר איריס מספריים | מדע כלים עדינים | 14058-11 | |
תקן פינצטה | מדע כלים עדינים | 11027-12 | |
זוג יפה (גרפה) פינצטה | מדע כלים עדינים | 11050-10 | |
1 hemostat מלקחיים גדולים - מעוגלים או ישרים (~~~HEAD=NNS 19 ס"מ) | surgicaltools.com | 17.21.51 | |
2 hemostat מלקחיים רגילים - ישר משוננים (14 ס"מ) | מדע כלים עדינים | 13013-14 | |
1 hemostat שונה (עם חור בקוטר 15 הגיש את קצה) | מדע כלים עדינים | 13013-14 | |
15-מחט מד בוטה או זית שקצהו (מחט זלוף) | Fisnar | 5601137 | |
זלוף: | |||
HyPerfusion מערכת או שווה ערך | |||
פוספט pH שנאגרו מלוחים, 7.4 | |||
Paraformaldehyde 4% במאגר M פוספט 0.1, pH 7.4 | |||
זכוכית שטוחה או מגש פלסטיק, כ 10 "x 10" | |||
קרח כתוש | |||
מי האמבט (37 ° C) | |||
שעון עצר | |||
50 מ"ל במזרק | Medline תעשיות | NPMJD50LZ | |
דיסקציה: | |||
אבאIR של תקן מספריים חדים ישרים / קהה (~~~HEAD=NNS 12 ס"מ) | מדע כלים עדינים | 14054-13 | |
Rongeurs מעוגלים או ישרים בינוני (14-16 ס"מ) או הסרת עצם הגולגולת צבת | מדע כלים עדינים | 16020-14 | |
ישר איריס מספריים (~~~HEAD=NNS 9 ס"מ) | מדע כלים עדינים | 14058-11 | |
מיקרו מרית (כפול 2 "קצוות שטוחים, אחד מעוגל, אחת קוני ל 1/8") | מדע כלים עדינים | 10091-12 | |
לאחר קיבוע & Storage: | |||
50 מ"ל בקבוקון זכוכית | |||
40 מ"ל HEPES שנאגרו הנקס פתרון (HBHS) עם אזיד הנתרן (90mg / L) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved