El ratón de prueba de natación forzada

Resumen

La prueba de natación forzada es validado como un método experimental para evaluar la eficacia de los antidepresivos potencial en los roedores. Animales de experimentación se colocan en un tanque de agua y escapar de comportamiento relacionado con la movilidad se cuantifica. Los procedimientos comunes para la versión de ratón de esta prueba se describen.

Resumen

La prueba de natación forzada es una prueba de roedores utilizados para la evaluación del comportamiento de los fármacos antidepresivos, la eficacia antidepresiva de nuevos compuestos, y las manipulaciones experimentales que tienen por objeto la prestación o la prevención de estados depresivos-como. Los ratones se colocan en un tanque transparente ineludible que se llena de agua y su comportamiento de huida relacionadas con la movilidad se mide. La prueba de natación forzada es sencillo de llevar a cabo de forma fiable y requiere un mínimo de equipo especializado. La implementación exitosa de la prueba de natación forzada requiere la adhesión a ciertos detalles de procedimiento y la minimización del estrés injustificado a los ratones. En la descripción del protocolo y el vídeo que acompaña, se explica cómo llevar a cabo la versión de ratón de esta prueba, con énfasis en peligros potenciales que pueden ser perjudiciales para la interpretación de los resultados y cómo evitarlos. Además, se explica cómo el comportamiento se manifiesta en la prueba se evalúan.

Protocolo

1. Material y Método

1.1. Los tanques de agua

Los tanques cilíndricos (30 cm de altura x 20 cm diámetro) requerido para la prueba de natación forzada del ratón (FST) en nuestro laboratorio se construyen de plexiglás transparente, ya que este material es capaz de soportar los frecuentes movimientos de los tanques y los accidentes mejor que el vidrio. El nivel del agua es de 15 cm del fondo y debe ser marcada en el tanque para asegurarse de que el volumen de agua es consistente a través de los ratones. El número de tanques idealmente debe ser al menos el doble que el número de ratones se está probando a la vez, de manera que el conjunto del tanque de agua segunda puede ser llenado mientras que el primer conjunto está en uso. Las dimensiones de los tanques deben ser seleccionados de tal manera que los ratones no será capaz de tocar el fondo del tanque, ya sea con los pies o la cola, en la prueba de natación. La altura del tanque debe ser lo suficientemente alta para evitar que los ratones se escape del tanque. Por favor, tenga en cuentaque el diámetro del tanque y la profundidad del agua son parámetros importantes que se pueden ajustar para cambiar el comportamiento de los ratones (para un análisis detallado de estos temas, ver ^1-3).

1.2. Termómetro

Un termómetro de infrarrojos resistente al agua, es preferible, ya que la medición rápida de la temperatura reduce la cantidad de tiempo requerido para llevar a cabo la prueba. Sin embargo, un termómetro de mercurio también será suficiente para esta tarea.

1.3. Temporizador

1.4. Dispositivo de grabación de vídeo

Usamos una cámara de vídeo con el apoyo de un trípode. Como esta prueba por lo general implica varios animales se está probando al mismo tiempo, puntuación en vivo, será muy difícil y no es aconsejable. La cámara de vídeo deben registrar en la resolución lo suficientemente alta para hacer una imagen de calidad que se utilizarán más adelante para la puntuación de comportamiento. Asegúrese siempre de que no hay memoria suficiente en la grabación de la cámara antes de Starting de la prueba. Usamos una cámara de vídeo que graba digitalmente sin el uso de medios mecánicos (es decir, cintas de vídeo), lo que permite la transferencia digital de videos. Si hay exceso de reflexiones sobre los tanques, que pueden ocurrir en entornos de laboratorio con iluminación fluorescente generales, es posible que desee utilizar un filtro polarizador del objetivo con la cámara.

1.5. Separadores

En nuestro laboratorio tenemos dos juegos de separadores (35 cm de altura x 22 cm de ancho x 22 cm de profundidad). Estos son rectangulares con tres paredes y se utilizan como fondo y como separadores entre los tanques para evitar que los ratones de ver entre sí durante la prueba y, potencialmente, alterar su comportamiento. Un juego puede ser de color negro para los animales de color albino y la luz, el otro puede ser de color claro para los animales de color oscuro con el fin de hacer un alto contraste. El experimentador debe asegurarse de que las superficies de los divisores no son muy reflectantes para que alterar imágenes de la cámara, o hacer mayor differences entre los niveles de iluminación.

1.6. Generador de ruido blanco

Esto es necesario en ambientes de laboratorio en el que ruidos fuertes y repentinos se puede escuchar que potencialmente podría asustar a los animales. El generador de ruido enmascara como sonidos molestos intermitente. El nivel de volumen del generador de ruido blanco debe ser seleccionado por encima de otros ruidos ambientales e inesperado. En nuestra sala experimental el nivel de ruido (sin el generador de ruido blanco activado) es de 60 dB. El nivel de ruido total con el generador de ruido blanco activado en el lugar donde se colocan los tanques es 70-72 dB. Sin embargo hay que señalar que estas cifras se proporcionan a modo de ejemplo solamente, y cada laboratorio debe seleccionar el nivel de ruido correcto de acuerdo con su entorno y circunstancias únicas.

1.7. Secado del papel y la lámpara de calor

Antes de regresar a los animales a sus jaulas, es importante que se sequesuavemente con toallas de papel y que es útil usar una lámpara de calor (tener la certeza de la temperatura de exposición no exceda de 32 ° C) para evitar la hipotermia.

2. Procedimientos de comportamiento

1. El diseño experimental en general debe reflejar contrapeso adecuado entre variables relativas a su experimento. Por ejemplo, en nuestros experimentos, tratamos de representar a cada grupo por igual en cada sesión de FST (es decir, si hay cuatro grupos de tratamiento, cada uno estará representado en cada sesión). Además, los ratones se rotan, de modo que los ratones de cada grupo de tratamiento se colocan en un tanque diferente en cada sesión.
2. Coloque la cámara y los separadores en su posición. La cámara debe estar lo más cerca posible a fin de obtener la mayor resolución posible de los ratones.
3. Los tanques deben ser llenados con agua de la llave fija en la temperatura ambiente (23-25 ​​° C) con el nivel determinado, que está marcado en las paredes del tanque. Si su instalación no tiene wa constante frío / calorter, es posible que desee para preparar el agua caliente y / o hielo para llevar rápidamente el agua a la temperatura correcta. Compruebe la temperatura del agua con el termómetro infrarrojo. Por otra parte, si las temperaturas de agua caliente y fría son constantes en sus instalaciones, se puede dibujar en el depósito de dos marcas - uno para el nivel de agua caliente y una segunda marca para la adición de agua fría - para acercarse a la final correcta la temperatura del agua rápidamente.
4. Iniciar el generador de ruido blanco, si se utilizan, antes de que los ratones son introducidos a la sala de pruebas. El nivel de ruido blanco sólo debe ser suficiente para enmascarar los ruidos externos. Evitar un alto volumen y asegúrese de que el mismo nivel de ruido blanco se utiliza para todos los animales.
5. Llevar a los animales en la sala de pruebas. Si la sala de la colonia donde residen los animales y la sala de pruebas son adyacentes o muy cerca unos de otros, las condiciones ambientales son similares y los disturbios durante el traslado de la jaula es mínimo, entonces no hay aclimatación period será necesario. De lo contrario, colocar los animales en la sala de pruebas por un período de aclimatación (por lo general al menos una hora). Si un período de aclimatación es necesario, asegúrese de que los animales aclimatados no se verá afectada por los ratones se está probando al mismo tiempo en la misma habitación. Tenga en cuenta que las señales olfativas y ultrasonido puede ser detectado por los animales que se hicieron en la misma habitación.
6. Iniciar la grabación de vídeo antes de colocar los animales en los tanques de agua.
7. Sujetar al animal por la cola y, con suavidad y poco a poco el lugar en el agua. Una vez que los ratones en el agua, liberan lentamente la cola. Por lo general, utilizando este procedimiento evitará que la cabeza del animal de ser sumergido bajo el agua.
8. Coloque el ratón en los tanques en un orden en el que se la obstrucción de la grabación minimizada. Esta orden, por supuesto, debe ser decidido en conjunto con el contrapeso de los grupos y otros requisitos específicos para el diseño experimental.
9. Una vez que todos los ratones se encuentran en los tanques en marcha la cuenta atrás en el cronómetro. La longitud de la prueba habitual para los ratones es de seis minutos en la FST.
10. Durante la prueba, asegúrese de que está a una distancia razonable de los animales y no hacer ningún movimiento o ruido que puede ser observado por los animales. Los ratones fácilmente puede flotar en el agua, sin embargo, si bien una nueva cepa de ratones o de un nuevo compuesto está probando sin conocimientos previos de sus efectos sobre el comportamiento de la natación, el experimentador debe controlar a los animales más de cerca. En contraste con las ratas, los ratones no suelen sumergirse en la FST, sin embargo en el caso de buceo con el ratón debe ser removido del tanque. Si el experimentador sale de la habitación los ratones debe ser vigilado por vídeo en el caso de que un ratón no puede mantener la natación y el comportamiento flotante y para detener la prueba si es necesario.
11. Al final del período de prueba de seis minutos detener la grabación. En nuestro laboratorio, se muestra una nota en la parte delantera de la cámara que identifica a los animales al finalde cada grabación. Cuando se utiliza este enfoque, el individuo posteriormente anotar la grabación no se conoce la identidad de los animales ya que la identidad sólo se muestra al final de la grabación. Esto evita que cualquier identificación y registro de los problemas que puedan ocurrir más adelante en relación con las grabaciones. Independientemente de la estrategia de mantenimiento de registros que se utiliza, se debe identificar claramente a los animales y evitar que el individuo después de puntuación de la prueba de que tenga conocimiento de las asignaciones de grupo.
12. Retirar los animales del agua por la cola en el mismo orden que los puso en cuidado y secar con un papel secante y colocar de nuevo en su homecage.

3. Análisis de la Conducta

1. La versión de ratón de la FST es por lo general, de principio a fin, seis minutos de duración. Sin embargo, en general, sólo los últimos cuatro minutos de la prueba son analizados. Esto se debe al hecho de que la mayoría de los ratones son muy activos a principios de la FST, y el pPOTENCIAL efectos del tratamiento puede ser oscurecida durante los primeros dos minutos.
2. En nuestro laboratorio hemos subir los archivos de vídeo directamente desde la cámara a un PC y hacer el análisis en el PC.
3. Durante el análisis de comportamiento, el tiempo que cada ratón pasa móviles se mide. La cantidad total de tiempo que la movilidad se resta de los 240 segundos de tiempo de prueba y luego se declaró como el tiempo de inmovilidad. Si bien es posible medir directamente el tiempo de inmovilidad, en nuestro laboratorio hemos encontrado que es más fácil de detectar y medir los movimientos de activos en lugar de la falta de estos movimientos.
4. El aspecto más importante de análisis de comportamiento y por lo general la mayor fuente de variabilidad entre los observadores en la FST es la identificación correcta de los movimientos que se cuentan como la movilidad de buena fe. Nuestra definición operativa de la movilidad en la FST es cualquier movimiento que no sean los necesarios para equilibrar el cuerpo y mantener la cabeza fuera del agua ⁴. Los ratones generalmente flotan en el agua con facilidad, sin embargo, todavía manifiestan los pequeños movimientos para equilibrar el cuerpo y mantener la cabeza fuera del agua. Estos comportamientos no son un intento de escapar y no debe ser calificado como la movilidad. Además, después de una sola sesión de la movilidad, aunque esencialmente inmóvil, los ratones todavía pueden desplazarse en el agua como resultado del impulso. Estos movimientos también no debe ser calificado como la movilidad.
5. En nuestro laboratorio, se utiliza un cronómetro en la pantalla de software (Xnote Cronómetro, dnSoft Grupo de Investigación) para la medición del tiempo. Dos cronómetros separados se utilizan en la pantalla. El primer cronómetro cuenta atrás de 240 segundos y avisa al observador, cuando el período de análisis de comportamiento extremos. El segundo cronómetro mide el tiempo dedicado a móviles. Algunos software cronómetro tiene la capacidad de asignar teclas para iniciar y detener funciones, por lo que en la pantalla cronómetros pueden ser controladas por el teclado. En nuestro laboratorio, en lugar de un teclado normal, se utiliza un dispositivo de entrada conocido comoun 'gamepad' para controlar los cronómetros.
6. Cuando se utiliza un PC para cuantificar la inmovilidad, si no es más que un ratón a prueba y presente en la pantalla, es una buena idea para cubrir los otros animales (se puede utilizar otra ventana del programa o físicamente cubrir la pantalla con el papel), de modo que sus movimientos no distraer al observador.
7. Si un cronómetro en la pantalla se utiliza, asegúrese de cubrir todos los decimales, pero milésima de segundo del cronómetro. La razón de esto es para evitar el sesgo en el observador, al tiempo que permite la capacidad de determinar si el reloj está corriendo o no. Desde el observador, mientras que ciega a las asignaciones de grupo de los animales, tendrá una idea general del nivel de movilidad en los ratones, podría haber algún sesgo que ocurre si se le permite ver la cantidad total de tiempo transcurrido para que la movilidad del ratón en particular antes de la finalización de la sesión de análisis. Al cubrir el cronómetro, sólo se sabrá si el cronómetro está activado o desactivado en cualquier momento, pero Will no sabe el tiempo total transcurrido y por lo tanto no se puede efectuar por cualquier sesgo.
8. Una prueba de fiabilidad inter-observador debe realizarse para cada nuevo observador antes de comenzar a recopilar datos de los animales de prueba. En nuestro laboratorio, cada nuevo observador primeros relojes una puntuación de observador experimentado. Después de que el nuevo observador va ganando confianza para diferenciar la movilidad de la inmovilidad, luego anotar con el observador experimentado mirando y señalando errores. Una vez que esta fase se completa con éxito, el nuevo observador a analizar un conjunto específico de videos FST que tenemos en nuestro laboratorio con fines de formación. Sólo después de un alto nivel de correlación inter-observador se obtiene con el observador experimentado es un comienzo investigador que analizó videos FST en experimentos reales. Guardamos los datos de estos análisis de la formación para constituir una norma interna para el laboratorio para su uso futuro. Hemos observado diferencias entre las cepas de la manera en la que expresan mobicalidad (y la inmovilidad) los comportamientos, y tiempo de inmovilidad media entre sexos. Cuando un nuevo modelo de cepa, sexo, o genéticamente modificados ratón se pone a prueba en el laboratorio es necesario para llevar a cabo una vez más este tipo de análisis de confiabilidad.

4. Resultados representante

Hay marcadas diferencias entre las cepas de ratón genéticamente diferentes puras y outbred en términos de su inmovilidad inicial y la respuesta a un medicamento específico ^5.11. Por ejemplo, identificamos a diferencia de los antidepresivos como respuesta al litio en un panel de cepas de ratón (Figura 1) ^5. Los detalles experimentales de este experimento se publican en Can et al., 2011 ^5.

Figura 1. Inmovilidad tiempo (en segundos) en la prueba de natación forzada, cinco horas después de una inyección ip de solución salina, 200, 300, o 400 mg / kg en puras y varios outbred cepas de ratón. *: P <0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001 indican una diferencia significativa en comparación con el grupo de solución salina, el test post hoc de Dunnett. Los datos se expresan como media ± SEM. Número de animales por grupo para cada cepa es de 6-8 (Figura reproducida de ^5).

No todas las cepas de ratones son adecuados para la FST. Algunas cepas, como Negro suizo, suizo NIH, y FVB / NJ muestran poca o casi inmovilidad no bajo condiciones de control, por lo tanto, lo que representa un efecto suelo (Figura 1) ^5. La falta de la inmovilidad de referencia efectivamente impide la detección de un efecto anti-depresivo de las manipulaciones experimentales. También es posible, aunque muy raro, que algunas cepas de ratón pueden comportarse de manera aberrante y sumergirse en el tanque durante la prueba a pesar de que puede flotar. Una cepa como es DBA/1OlaHsd (observaciones no publicadas en nuestro laboratorio). Estas cepas no son adecuados para la FST. Debido a este riesgo de buceo, sin embargo Small, cuando se prueba una nueva cepa que no haya sido previamente probado en la FST o un ratón de albergar una manipulación genética novedosa, es imperativo observar con cuidado las pruebas iniciales para rescatar a los ratones si se involucran en comportamientos potencialmente dañinos.

En el diseño del experimento descrito aquí, varios animales (hasta cinco) se ponen a prueba al mismo tiempo. Mientras que los separadores que utilizan evitar que los ratones de ver entre sí durante la prueba, y el generador de ruido blanco suprime vocalizaciones audibles, los reglajes no impide que todas las señales de ultrasonido u olfativas que se transmiten. Aunque es poco probable dada la naturaleza de la prueba, estos pueden afectar el comportamiento de los ratones. Una solución a este problema sería la prueba individual de los animales. Sin embargo, este enfoque tiene sus propios problemas. Por ejemplo, comúnmente, los animales estudiados en cada sesión provienen de la misma homecage. Esto permite la aleatorización y contrapeso de las variables experimentales. Pruebas individuales de los ratonesmente significaría la eliminación de un ratón en un momento de la homecage. Esto hará que el esfuerzo repetido y la alteración de la jerarquía social en la jaula entre los otros quedan atrás. Otro problema con las pruebas por separado son las limitaciones de tiempo. Prueba de un ratón a la vez que ampliar el experimento a muchas horas dando como resultado una situación en la que los ratones se ponen a prueba en diferentes momentos del ciclo circadiano. Esto puede crear confusión tiempo de los efectos de los días. Los investigadores deben tener en cuenta estas cuestiones, mientras que el diseño de sus experimentos.

Discusión

La FST (a veces llamada prueba de natación Porsolt) fue desarrollado por primera vez para las ratas y ratones modificados para Porsolt y sus colegas ^12,13. Además de los protocolos descritos anteriormente con éxito en nuestro laboratorio, un gran número de modificaciones sutiles pruebas se han publicado (ver Hascoët y Bourin para una revisión completa ^1). Se trata de una prueba común para la evaluación de la eficacia de los fármacos antidepresivos y los efectos de varias manipulaciones de ...

Materiales