마우스 강제 수영 시험

요약

강제 수영 시험은 설치류 동물의 잠재적인 약은 효험을 평가하기위한 실험 방법으로 확인됩니다. 실험 동물은 물과 탈출 관련 이동성 행동의 탱크에 배치됩니다 계량입니다. 이 테스트의 마우스 버전에 대한 일반적인 절차가 설명되어 있습니다.

초록

강제 수영 시험 약은 의약품, 새로운 화합물의 약은 효능, 그리고 미국과 같은 우울증을 렌더링하거나 예방하기위한 아르 실험 조작의 평가에 사용되는 쥐 행동 테스트입니다. 마우스는 물로 가득 차 있으며, 그들의 탈출 관련 이동성 행동 측정 피할 투명한 수조에 배치됩니다. 강제 수영 시험은 안정적으로 수행할 수 있도록 간단하고 최소한의 전문적인 장비를 필요로합니다. 강제 수영 시험의 성공적인 구현은 생쥐에게 부당한 스트레스의 특정 절차 내용 및 최소화하기 위해 준수해야합니다. 프로토콜 설명과 함께 동영상에서 우리는 어떻게 그들을 피하기 위해 결과의 해석 및 저해 될 수있는 잠재적인 함정에 중점이 시험의 마우스 버전을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 또한, 우리는 시험에 나타나신 행동이 평가 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 재료 및 방법

1.1. 물 탱크

이 자료는 유리보다 탱크와 사고의 빈번한 움직임을 견딜 수있는 같은 원통형 탱크 (30cm 높이 X 20cm의 직경)은 투명한 플렉시의 건설에 우리 연구실에서 마우스 강제 수영 시험 (FST)을 위해 필요합니다. 수위가 바닥에서 15cm이며, 물의 볼륨이 생쥐에 걸쳐 일관성이 있는지 확인하기 위해 탱크에 표시된해야합니다. 탱크의 수는적으로 첫 번째 세트를 사용하는 동안 두 번째 수조 세트가 가득 수 있도록 한 번에 테스트중인 생쥐의 숫자로 최소한 두 배나 많은하여야한다. 탱크의 크기는 생쥐가 수영 테스트가 진행되는 동안, 발에이나 꼬리와 함께하거나, 탱크의 바닥을 만지​​는 수 없습니다되는 방법으로 선택하여야한다. 탱크의 높이가 수조에서 탈출에서 쥐를 방지하기 위해 충분히 높은되어야합니다. 유의하시기 바랍니다탱크의 직경과 수심이 생쥐의 행동을 (이러한 문제에 대한 자세한 분석 ^{1-3 참조)} 변경 조정할 수 있습니다 중요한 매개 변수는 것을.

1.2. 온도계

온도의 빠른 측정 테스트를 실시하기 위해 필요한 시간의 양을 감소 이후 물 모성 적외선 온도계는 것이 바람직합니다. 그러나, 유리 수은 온도계는이 작업에 대한 충분한 것입니다.

1.3. 타이머

1.4. 비디오 녹화 장치

우리는 삼각대 지원 비디오 카메라를 사용합니다. 이 검사는 일반적으로 동시에 테스트하고 여러 동물과 관련된 때문에, 라이브 점수는 매우 어려운하고 권장되지 않습니다 것입니다. 비디오 카메라는 행동 채점을 위해 나중에 사용됩니다 품질의 사진을 렌더링하는만큼 충분히 높은 해상도로 기록한다. 항상 인제하기 전에 카메라에 충분한 녹음 메모리가 있는지 확인g 테스트. 우리는 동영상의 디지털 전송을 위해 수 있도록, 기계 매체의 사용 (즉, 비디오 카세트)가없는 디지털 기록하는 비디오 카메라를 사용합니다. 오버헤드 형광 조명과 실험실 환경에서 발생할 수있는 탱크에 과도한 반사가있다면, 당신은 카메라와 렌즈 편광 필터를 사용할 수 있습니다.

1.5. 분할기

우리 연구실에서는 디바이더 두 세트 (35cm X 높이 22cm X 폭 22cm 깊이)을했습니다. 이러한 세 가지 벽 직사각형이며 모두 배경으로하고 테스트하는 동안 서로를보고 잠재적으로 자신의 행동을 변경에서 마우스를 방지하기 위해 탱크 사이에 디바이더로 사용됩니다. 한 세트 흰둥이와 밝은 색깔의 동물에 대한 검정 수 있으며, 다른 설정은 높은 콘트라스트를 렌더링하기 위해 어두운 색깔의 동물에 대한 색 빛이하실 수 있습니다. 실험자들은 카메라 이미지를 변경하거나, 주요 D를 렌더링 있도록 디바이더의 표면이 지나치게 반사되지 않도록해야조명 수준 사이 ifferences.

1.6. 화이트 노이즈 생성기

이것은 갑자기 큰 소리가 잠재적으로 동물을 놀라게 것이 들어있을 수있는 실험실 환경에서 필요합니다. 소음 발생기는 간헐적인 방해 소리를 마스크합니다. 백색 잡음 발생기의 볼륨 레벨이 다른 주변과 예상치 못한 소음 이상으로 선택해야합니다. 우리의 실험 공간에서 주위 소음 수준 (작동 백색 잡음 발생기 제외) 60dB입니다. 탱크가 배치되는 위치에 활성화된 백색 잡음 발생기와 함께 총 소음 수준은 70-72dB 있습니다. 그러나 이러한 수치는 예를 들어 전용으로 제공하는 것을인지해야하고, 각 연구소는 독특한 환경과 상황에 따라 권리가 소음을 선택해야합니다.

1.7. 건조 종이와 가열 램프

자신의 홈 연습장 동물을 반환하기 전에 건조하는 것이 중요합니다그들 부드럽게 종이 타올을 사용하고 그것은 저체온증을 방지하기 위해 (노출 온도가 32을 초과하지 않는 확신 ° C) 가열 램프를 사용하는 도움이됩니다.

2. 행동 절차

1. 전체 실험 설계는 실험에 특정 변수 사이의 적절한 counterbalancing을 반영해야합니다. 예를 들어, 실험에서 우리는 똑같이 모든 FST 세션 (즉, 넷 치료 그룹이있다면, 각 각 세션에 표시됩니다)에서 각 그룹을 대표하려고합니다. 또한, 마우스가 회전되며, 각 치료 그룹에서 같은 것을 마우스는 각 세션에서 다른 탱크에 배치됩니다.
2. 카메라와 위치에 디바이더를 놓습니다. 카메라는 생쥐의 가능한 가장 높은 해상도를 얻기 위해서는 최대한하여야한다.
3. 탱크는 탱크 벽에 표시된 결정 수준으로 실내 온도 (23-25​​ ° C)에서 설정 수돗물로 가득해야합니다. 귀하의 시설은 일정한 고온 / 추위 WA가없는 경우ter, 당신은 신속하게 적당한 온도로 물을 가지고 뜨거운 물 및 / 또는 얼음을 준비 할 수 있습니다. 적외선 온도계로 물의 온도를 확인합니다. 뜨거운 물의 수준에 대한 하나 냉수의 추가에 대한 두 번째 마크 - - 또는 온수 및 냉수의 온도가 시설에서 지속하는 경우, 당신은 탱크 이마르크에 그릴 수있는 올바른 최종 접근로 빠르게 수온.
4. 사용중인 경우에는 생쥐가 테스트 룸으로 도입되기 전에, 백색 잡음 발전기를 시작합니다. 백색 소음의 수준은 외부 소음을 마스크로 충분합니다. 높은 볼륨을 방지하고 백색 잡음 같은 수준의 모든 동물에 사용되고 있는지 확인하십시오.
5. 테스트 룸에 동물을 가져와. 동물이있는 식민지 룸과 테스팅 룸이 인접해 있거나 서로 매우 가까운 경우, 주위 조건은 유사하며 새장 이동 중에 방해가 더 acclimation 아름다운 요정 후, 최소한 없습니다OD가 필요합니다. 그렇지 않으면, acclimation의 기간 (일반적으로 최소한 1 시간)에 대한 테스트 룸에 동물을 배치. acclimation 기간이 필요한 경우, acclimated 동물이 같은 방에 동시에 테스트중인 생쥐에 의해 영향을받지 않습니다 있는지 확인하십시오. 후각과 초음파 단서가 같은 방에 배치 다른 동물에 의해 감지 수 있습니다 양해하여 주시기 바랍니다.
6. 물 탱크에 동물을 배치하기 전에 비디오 녹화를 시작합니다.
7. 꼬리로 동물을 보유하고 부드럽게 천천히 물에 넣습니다. 생쥐가 물에되면 천천히 꼬리를 놓습니다. 일반적으로,이 절차를 사용하면 물 속에 가라 앉되는 동물의 머리를 방지할 수 있습니다.
8. 녹음의 방해가 최소화됩니다되는 순서대로 탱크에있는 생쥐를 놓습니다. 이 명령은 물론, 그룹 및 실험 디자인에 맞는 다른 요건의 counterbalancing 함께 결정되어야합니다.
9. 일단 모든 생쥐는 스톱워치의 탱크 - 시작 카운트 다운에 있습니다. 생쥐에 대한 일반적인 테스트 길이는 FST 여섯 분 거리에 있습니다.
10. 테스트하는 동안 당신이 동물에서 적당한 거리에 있으며, 동물에 의해 발견 될 수있는 움직임이나 소리를하지 않는 특정 수 있습니다. 마우스는 쉽게 어느 생쥐이나 수영 행위에 대한 그들의 영향의 이전 지식없이 테스트중인 새로운 화합물의 새 변종은 실험자들이 더 가깝게 동물을 모니터링해야하는 경우 그러나, 물에 떠 있습니다. 쥐와는 달리, 마우스는 일반적으로 그러나 다이빙의 경우 마우스가 탱크에서 제거되어야 FST 동안 다이빙하지 않습니다. 실험자들은 생쥐가 마우스 동작을 수영과 부동 유지할 수 있으며, 필요한 경우 시험을 중지되는 경우의 비디오에 의해 모니터링되어야 방을 떠나면.
11. 육분 시험 기간의 끝에 녹음을 중지합니다. 우리가 실험실에서, 우리는 매우 끝에있는 동물을 식별하는 카메라 앞에 메모를 표시각 기록. 정체성에만 녹음의 매우 끝 부분에 표시되기 때문에이 방법을 사용하면 이후에 녹음을 채점 개인은 동물의 신원을 알 수 없습니다. 이것은 나중에 레코딩에 관한 발생할 수있는 문제를 유지하는 식별 및 기록을 방지할 수 있습니다. 에 관계없이 사용되고 기록 유지 전략, 그것은 분명 동물을 파악해야하며 나중에 그룹 과제의 지식을 필요에서 시험을 채점 개인을 방지.
12. 당신이 그들을 넣어 부드럽게 돌려 homecage에 건조 종이와 장소 그들을 건조하는 것과 같은 순서로 자신의 꼬리로 물을에서 동물을 제거합니다.

3. 행동 분석

1. FST의 마우스 버전은 긴 6 분 처음부터 끝까지, 일반적입니다. 그러나, 일반적으로 시험은 마지막 네 분 분석하고 있습니다. 이것은 대부분의 생쥐는 FST의 시작 부분에서 매우 활성화되어있다는 사실로 인해이며, P치료 otential 효과는 처음 두 분 동안 드러나지 수 있습니다.
2. 저희 연구실에서는 PC에 카메라에서 직접 비디오 파일을 업로드하고 PC에 분석을 않습니다.
3. 행동 분석하는 동안, 각 쥐가 모바일 지출되는 시간이 측정됩니다. 이동성 시간의 총 금액은 다음 테스트 시간의 240초에서 빼서는 다음 부동 시간으로 적혀있다. 그것이 직접 부동 시간을 측정 가능하지만, 저희 연구실에 우리는 쉽게 오히려 그러한 움직임의 부족보다 적극적인 움직임을 감지하고 측정 발견했다.
4. FST의 행동 분석 및 일반적으로 관찰자 사이의 변화의 가장 큰 소스의 가장 중요한 부분은 타고난 이동성으로 계산됩니다 움직임의 정확한 식별합니다. FST의 이동성을위한 우리의 운영 정의는 신체의 균형과 물 ⁴ 위에 머리를 유지하는 데 필요한 이외의 운동이다. 마우스는 일반적으로 쉽게, 그러나 그들이 아직 그들의 시체를 균형 물 위에 머리를 유지하기 위해 작은 움직임을 참고 물에 떠. 이러한 행동은 탈출하고 이동성으로 득점하지 않아야 시도되지 않습니다. 또한, 이동성의 단일 시합 후,에도 불구하고 본질적으로 고정되어 있으며, 마우스는 아직 추진력의 결과로 물 속에 표류 수 있습니다. 이러한 움직임은 또한 이동성으로 채점되지 않습니다.
5. 저희 연구실에서는, 우리는 시간 측정을위한 화면 스톱워치 소프트웨어 (Xnote 스톱워치, dnSoft 연구 그룹)을 사용합니다. 두 개의 스톱워치는 화면에 사용됩니다. 때 행동 분석 기간이 끝나는 첫 번째 스톱워치가 다운 2백40초 및 경고에서 관찰자로 계산됩니다. 두 번째 스톱워치는 시간이 모바일 보낸 측정합니다. 일부 스톱워치 소프트웨어는 화면에 스톱워치가 키보드로 제어할 수 있도록 기능을 시작하고 중지 키를 할당할 수있는 능력이 있습니다. 우리가 실험실에서 대신 일반 키보드의, 우리는 일반적으로 알려진 입력 장치를 사용하여스톱워치를 제어하는​​ 'gamepad.
6. 테스트 화면에있는 하나 이상의 마우스가있는 경우, 부동을 계량하기 위해 PC를 사용하면 있도록 (당신은 다른 프로그램 윈도우를 사용하거나 물리적으로 종이 화면을 커버 가능) 다른 동물을 커버하는 것이 좋습니다 그들의 움직임은 관찰자주의를 분산하지 않습니다.
7. 화면에 스톱워치를 사용하는 경우, 모든하지만 스톱워치의 밀리초 소수 커버 특정 수 있습니다. 이에 대한 이유는 아직 시계가 실행 중이거나 실행되지 않는 있는지 확인하는 기능을 허용하면서, 관찰자​​의 편견을 방지하는 것입니다. 관찰자는 동물의 그룹 과제에 장님 동안 생쥐의 이동성의 수준에 대한 일반적인 생각을해야하기 때문에, 그녀가 특정 마우스 경과 이동성 시간의 총 금액을 볼 수있다면 현상 바이어스가있을 수 있습니다 전에 분석 세션 완료. 스톱워치를 덮고함으로써, 그녀는 스톱워치 어떤 시점에서 켜거나지만 줘야해 여부를 알 수 있습니다난 총 시간 경과 따라서 어떤 편견에 의해 영향을 수없는 알지 없습니다.
8. 시험 동물에서 데이터를 수집하기 시작하기 전에 간 관찰자의 신뢰성 시험은 모든 새 관찰자에 대해 실시한다. 저희 연구실에서는 각각의 새 관찰자 먼저 경험 관찰자 점수를 감시합니다. 부동의 이동성을 차별화하는 데 새로운 관찰자가 탄력을 신뢰하면, 그들은 다음 경험 관찰자가 관찰하고 실수를 지적과 점수. 이 단계가 성공적으로 완료되면, 새로운 관찰자 우리가 훈련을 위해 저희 연구실에 보관하는 것이 FST 동영상의 특정 집합을 분석합니다. 상호 관찰자 간 상관 관계가 높은 수준은 경험이 풍부한 관찰자로 얻은 후에만 실제 실험에 FST 비디오를 분석 조사 시작 않습니다. 우리는 보관이 훈련 분석의 데이터는 나중에 사용하기 위해 실험실에 대한 내부 기준을 구성합니다. 우리는 그들이 mobi을 표현하는 방식으로 변종 사이의 차이를 관찰했습니다lity (및 부동) 행동하고, 남녀 사이의 의미 부동 시간. 새로운 변형, 성별, 또는 유전자 조작 마우스 모델 실험실에서 테스트하는 경우는 다시 신뢰성 분석의 유형을 실시하는 것이 필요합니다.

4. 대표 결과

자신의 기준 부동과 특정 약물 ^5-11에 대응 측면에서 유전자 뚜렷한 근친과 outbred 마우스 종자 간의 표시된 차이가 있습니다. 예를 들어, 마우스 종자의 패널 (그림 1) ⁵ 리튬하기 위해 차동 약은 같은 답변을 확인. 본 실험의 실험 자세한 내용은 수 외. 2011 년 ⁵ 출판하고 있습니다.

그림 1. 강제 수영 시험에서 부동 시간 (초) 5 시간 다양한 근친과 OU에 염분, 200, 300, 또는 400 밀리그램 / kg의 단일 IP 주사 후마우스 변종을 tbr​​ed. * : P <0.05, ** : P <0.01, *** : P <0.001은 식염수 그룹 Dunnett의 게시물 특별 시험에 비해 상당한 차이를 나타내는. 데이터는 ± SEM 의미로 표현됩니다. 각 변형에 대한 그룹당 동물의 개수 6-8 ⁽⁵ 재현 그림)입니다.

모든 마우스 종자는 FST에 적합합니다. 같은 블랙 스위스, NIH 스위스, 그리고 FVB / NJ 같은 일부 변종 따라서 바닥 효과 (그림 1) ^5를 나타내는, 제어 조건 하에서 거의 거의없이 부동을 보여줍니다. 기준 부동의 부족 효과적으로 실험 조작의 방지 depressant 효과를 감지하지 못하도록합니다. 그것은 그들이 뜨나에도 몇 가지 마우스 종자가 aberrantly 행동과 테스트 기간 동안 수조에 다이빙 수있는, 아주 드문 반면 수도 있습니다. 하나는 이러한 변형은 (저희 연구실에 게시되지 않은 전망대) DBA/1OlaHsd입니다. 이러한 변종은 FST에 적합하지 않습니다. 때문에 다이빙의 위험, 그러나 smal난, 이전에 FST이나 소설 유전자 조작을 품고 마우스 테스트되지 않았습니다 새로운 긴장을 테스트를 할 때, 그것은 신중하게 그들이 잠재적으로 유해한 행동에 관여하는 경우 마우스를 구출하기 위해 초기 실험을 관찰하기 위해 필수적입니다.

실험 설계의 여러 동물 (최대 다섯)를 동시에 테스트, 여기에 설명되어 있습니다. 우리가 사용하는 디바이더가 테스트하는 동안 서로를 볼 마우스를 방지하고, 백색 잡음 발생기는 가청 vocalizations를 억제하는 동안, 우리의 설정은 전송되는 모든 초음파 또는 후각 단서를 방지하지 않습니다. 가능성 테스트의 성격을 부여하지만, 이들은 생쥐의 행동에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 해결하는 한 가지 방법은 개별적으로 동물을 테스트하는 것입니다. 그러나,이 방법은 자체적으로 문제가 있습니다. 예를 들어, 일반적으로, 각 세션에서 테스트 동물 같은 homecage에서 온. 이것은 임의화 및 실험 변수 counterbalancing 수 있습니다. 쥐 개별 테스트정가 homecage에서 한 번에 하나의 마우스를 제거 의미할 것입니다. 이것은 뒤에 남아있는 다른 사람 사이의 새장에 반복 응력과 사회 계층의 교란을 일으킬 것입니다. 테스트와 함께 또 다른 문제는 단독으로 시간의 제약이 있습니다. 한 번에 하나씩 마우스를 테스트하면 생쥐는 circadian주기의 서로 다른 시간에 테스트하는 상황에서 발생 몇 시간에 실험을 연장합니다. 이것은 하루 효과 혼란함을 주죠 시간을 만들 수 있습니다. 그들의 실험을 설계하면서 연구자 마음에 이러한 문제를 계속해야합니다.

토론

FST는 (때로는 Porsolt 수영 테스트라고도 함) 쥐에 대한 첫번째 개발하고 Porsolt 및 동료 ^12,13으로 마우스에 대한 바뀌었습니다. 저희 연구실에서 성공 위에서 설명한 프로토콜 이외에, 대부분 섬세한 테스트 수정의 번호 (완전한 검토 ¹ Hascoët 및 Bourin 참조) 출판되었습니다. 그것은 안티 - depressant, 마약, 그리고 기본 및 잠복기 연구 ^3,14-16의 다양한 행동 및 신경 생물학 조작의...

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