Die Maus Forced Swim-Test

Zusammenfassung

Der Forced Swim Test wird als ein experimenteller Ansatz, um mögliche antidepressive Wirksamkeit in Nagetieren zu beurteilen validiert. Versuchstiere werden in einen Behälter mit Wasser und die Flucht-bezogene Mobilitätsverhalten gelegt wird quantifiziert. Das gemeinsame Verfahren für die Maus-Version dieses Tests sind beschrieben.

Zusammenfassung

Der Forced Swim Test ist ein Nagetier Verhaltenstest für die Auswertung von Antidepressiva, antidepressive Wirksamkeit von neuen Verbindungen und experimentelle Manipulationen, die beim Rendern oder verhindert depressive wie Staaten gerichtet werden. Mäuse sind in eine unausweichliche transparenten Behälter, die mit Wasser gefüllt ist und ihre Flucht im Zusammenhang Mobilitätsverhalten wird gemessen platziert. Der Forced Swim Test ist unkompliziert, zuverlässig durchzuführen, und es erfordert nur minimale Ausrüstung zur Verfügung. Erfolgreiche Umsetzung des Forced Swim Test erfordert die Einhaltung bestimmter Einzelheiten des Verfahrens und die Minimierung der ungerechtfertigten Belastung der Mäuse. In dem Protokoll Beschreibung und den beigefügten Video erläutern wir, wie Sie die Maus-Version dieses Tests mit dem Schwerpunkt auf potenzielle Fallstricke, die sich nachteilig auf die Interpretation der Ergebnisse und wie sie vermieden werden können befragen. Darüber hinaus erklären wir, wie das Verhalten in den Test manifestiert bewertet werden.

Protokoll

1. Materialien und Methode

1.1. Die Wassertanks

Der zylindrische Tanks (30 cm Höhe x 20 cm Durchmesser) für die Maus Forced Swim Test (FST) in unserem Labor erforderlich sind, aus transparentem Plexiglas gebaut, da dieses Material in der Lage, die häufige Bewegung des Tanks und Unfälle besser als Glas widerstehen. Der Wasserstand ist 15 cm aus dem Boden und sollte auf dem Tank, um sicherzustellen, dass das Volumen des Wassers konsistent Mäusen markiert werden. Die Zahl der Tanks sollte idealerweise mindestens doppelt so viele wie die Anzahl der Mäuse zu einem Zeitpunkt getestet, so dass der zweite Wassertank befüllt werden kann, während der erste Satz ist im Einsatz sein. Die Abmessungen der Tanks sollte in einer Weise, dass die Mäuse nicht in der Lage auf den Boden des Behälters berühren, entweder mit den Füßen oder mit dem Schwanz, während der Baden-Test ausgewählt werden. Die Höhe des Tanks sollte hoch genug sein, um die Mäuse an der Flucht aus dem Tank zu verhindern. Bitte beachten Sie,dass der Durchmesser der Tank und die Tiefe des Wassers sind wichtige Parameter, die angepasst an das Verhalten von Mäusen (für eine detaillierte Analyse dieser Fragen siehe ^1-3) ändern können.

1.2. Thermometer

A wasserdicht Infrarot-Thermometer ist vorzuziehen, da eine schnelle Messung der Temperatur reduziert die benötigte Zeit, um den Test durchzuführen. Allerdings wird ein Glas Quecksilber-Thermometer auch ausreichend sein, für diese Aufgabe.

1.3. Timer

1.4. Video Aufnahmegerät

Wir verwenden eine Videokamera um ein Stativ. Da dieser Test in der Regel umfasst mehrere Tiere zur gleichen Zeit getestet werden Livescoring sehr schwierig und nicht ratsam. Die Videokamera sollte in ausreichend hoher Auflösung aufzeichnen zu einer Bildqualität, die später für Verhaltens-Scoring verwendet werden rendern. Achten Sie darauf, genügend Speicherkarten mit in die Kamera, bevor starting des Tests. Wir verwenden eine Video-Kamera, die digital Datensätze ohne den Einsatz mechanischer Medien (zB Video-Kassette), so dass für die digitale Übertragung von Videos. Wenn es übermäßige Reflexionen auf die Panzer, die in Labor-Umgebungen mit Overhead Fluoreszenzbeleuchtung auftreten können, sind, möchten Sie vielleicht eine polarisierende Linse Filter mit Ihrer Kamera verwenden.

1.5. Dividers

In unserem Labor haben wir zwei Sätze von Teilern (35 cm Höhe x 22 cm Breite x 22 cm Tiefe). Diese sind rechteckig mit drei Wänden und sind sowohl als Hintergrund und als Raumteiler zwischen den Tanks, um Mäuse einander sehen, während der Prüfung und möglicherweise zu verändern ihr Verhalten zu verhindern. Ein Satz kann für Albino und helle Tiere schwarz, die andere einstellen können helle für dunkle Tiere werden, um einen hohen Kontrast zu rendern. Der Versuchsleiter sollte sicherstellen, dass die Oberflächen der Trennwände sind nicht übermäßig reflektierende, so dass sie Kamerabilder ändern oder machen große differences zwischen Beleuchtungsstärke.

1.6. Weißes Rauschen-Generator

Dies ist im Labor Umgebungen, in denen plötzliche laute Geräusche hörte, dass würde möglicherweise erschrecken die Tiere werden musste. Der Rauschgenerator wird Maske wie intermittierende störende Geräusche. Die Lautstärke des weißen Rauschens Generator zu wählen, über andere Umgebungs-und unerwartete Geräusche werden. In unseren experimentellen Raum Geräuschpegel der Umgebung (ohne das weiße Rauschen-Generator aktiviert) beträgt 60 dB. Die gesamte Lärmpegel mit dem weißen Rauschen-Generator an der Stelle, wo die Tanks platziert aktiviert ist 70-72 dB. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass diese Zahlen nur als Beispiel zur Verfügung gestellt werden, und jedes Labor sollte das Recht Geräuschpegel entsprechend ihrer einzigartigen Umgebung und Umstände zu wählen.

1.7. Trocknung von Papier und Wärmelampe

Vor Rücksendung der Tiere auf ihre Käfige, ist es wichtig, trockensie vorsichtig mit Küchenpapier und es ist hilfreich, eine Wärmelampe verwenden (sicher sein, die Belichtung Temperatur nicht über 32 ° C), um eine Unterkühlung zu verhindern.

2. Behavioral Procedures

1. Der gesamte Versuchsaufbau widerspiegeln richtigen Ausgleich zwischen Variablen für Ihre Experimente. Zum Beispiel in unseren Experimenten versuchen wir, jede Gruppe gleich in jeden FST-Sitzung (dh, wenn es vier Behandlungsgruppen sind, jeder wird in jeder Sitzung vertreten sein) vertreten. Auch Mäuse gedreht werden, sind derart, dass Mäuse aus jeder Behandlungsgruppe in einen anderen Tank in jeder Sitzung gesetzt.
2. Legen Sie die Kamera und die Teiler in Position. Die Kamera sollte so nah wie möglich sein, um die höchstmögliche Auflösung der Mäuse zu erhalten.
3. Die Tanks sollten mit Leitungswasser bei Raumtemperatur (23-25 ​​° C), um die festgelegte Höhe, die an der Tankwand gekennzeichnet ist befüllt werden. Wenn Ihre Anlage nicht konstant warm / kalt water, können Sie warmes Wasser und / oder Eis vorzubereiten, um schnell bringen das Wasser auf die richtige Temperatur. Prüfen Sie die Wassertemperatur mit dem Infrarot-Thermometer. Eine für das Niveau von heißem Wasser und einer zweiten Marke für die Zugabe von kaltem Wasser - - Alternativ, wenn die Temperaturen von heißem und kaltem Wasser konstant sind in Ihrer Einrichtung können Sie auf dem Tank beiden Marken ziehen, um nahe an die richtige endgültige Wassertemperatur schnell.
4. Starten Sie das weiße Rauschen, wenn verwendet wird, bevor die Mäuse auf den Prüfraum eingebracht werden. Der Pegel des weißen Rauschens sollte nur genug, um Außengeräusche Maske. Vermeiden Sie eine hohe Lautstärke und stellen Sie sicher, das gleiche Niveau von weißem Rauschen wird für alle Tiere verwendet.
5. Bringen Sie die Tiere in den Testraum. Wenn die Kolonie, wo die Tiere leben und den Testraum benachbart sind oder sehr nahe beieinander liegen, sind die Umgebungsbedingungen ähnlich und die Störung während der Bewegung des Käfigs ist minimal, so ist keine Akklimatisierung period notwendig sein wird. Andernfalls setzen Sie die Tiere in den Prüfraum für einen Zeitraum von Akklimatisation (in der Regel mindestens eine Stunde). Wenn ein Akklimatisierungsperiode ist notwendig, sicherzustellen, dass die Tiere eingewöhnt nicht von den Mäusen wird zur gleichen Zeit im gleichen Raum getestet betroffen sein. Bitte beachten Sie, dass Geruchs-und Ultraschall-Signale von den anderen Tieren im gleichen Raum platziert werden können erfasst werden.
6. Starten Sie Videoaufnahmen, bevor die Tiere in die Wassertanks.
7. Halten Sie das Tier am Schwanz, und langsam und vorsichtig in das Wasser statt. Nachdem die Mäuse im Wasser, langsam loslassen den Schwanz. Typischerweise werden mit diesem Verfahren den Kopf des Tieres entfernt, unter Wasser getaucht zu verhindern.
8. Legen Sie die Maus in die Tanks in einer Reihenfolge, in der die Behinderung der Aufnahme minimiert werden. Dieser Auftrag sollte natürlich in Verbindung mit dem Ausgleich von Gruppen und anderen spezifischen Anforderungen für Ihr experimentelles Design entschieden werden.
9. Sobald alle Mäuse sind in den Tanks-Start des Countdowns auf die Stoppuhr. Die üblichen Teststrecke für Mäuse beträgt sechs Minuten in der FST.
10. Während des Tests sicher sein, Sie sind in einem angemessenen Abstand von den Tieren und machen keine Bewegungen oder Geräusche, die von den Tieren bemerkt werden kann. Mäuse können sich leicht in Wasser schwimmen, aber wenn entweder ein neuer Stamm von Mäusen oder einer neuen Verbindung wird ohne Vorkenntnisse ihre Wirkung auf Schwimmverhalten getestet, der Versuchsleiter sollte die Tiere genauer zu überwachen. Im Gegensatz zu Ratten, Mäusen zu tun in der Regel nicht während des FST tauchen jedoch im Falle des Tauchens mit der Maus aus dem Tank entfernt werden sollte. Wenn der Experimentator den Raum verlässt den Mäusen per Video für den Fall, dass eine Maus kann nicht behaupten, Schwimmen und schwimmende Verhalten und auf die Probe gegebenenfalls zu stoppen sollten überwacht werden.
11. Am Ende der 6 Minuten Testzeit die Aufnahme zu beenden. In unserem Labor zeigen, dass wir einen Zettel vor die Kamera, dass die Tiere identifiziert ganz am Endejeder Aufnahme. Bei dieser Vorgehensweise die einzelnen anschließend Scoring wird die Aufnahme nicht, die Identität der Tiere, da die Identität ist erst ganz am Ende der Aufnahme angezeigt. Dies verhindert, dass Identifikations-und Aufzeichnungspflichten Probleme, die später auftreten können, in Bezug auf die Aufnahmen. Unabhängig von der Aufzeichnungspflicht Strategie, die verwendet wird, sollte es eindeutig die Tiere und auch verhindern, dass die einzelnen später erzielte der Test aus Kenntnis von Gruppenzugehörigkeiten.
12. Entfernen Sie die Tiere aus dem Wasser an ihren Schwänzen in der gleichen Reihenfolge, dass man sie in und schonend trocknen sie mit einem Trocknen von Papier und legen Sie wieder in ihre homecage.

3. Behavior Analysis

1. Die Maus-Version von FST ist in der Regel, von Anfang bis Ende, sechs Minuten lang. Allerdings, in der Regel nur die letzten 4 Minuten des Tests analysiert werden. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass die meisten Mäuse sehr aktiv sind, zu Beginn des FST, und die pOTENTIAL Wirkungen der Behandlung kann während der ersten zwei Minuten verdunkelt werden.
2. In unserem Labor stellen wir Ihnen die Video-Dateien direkt von der Kamera an einen PC und führen Sie die Analyse auf dem PC.
3. Während der Verhaltensanalyse ist die Zeit, die jeder Maus verbringt mobilen gemessen. Der Gesamtbetrag der Mobilität der Zeit wird dann aus den 240 Sekunden der Testzeit subtrahiert und wird dann als die Unbeweglichkeit der Zeit angegeben. Während es möglich ist, die Unbeweglichkeit der Zeit direkt zu messen, die in unserem Labor haben wir festgestellt, es einfacher zu erkennen und zu messen aktiven Bewegungen, anstatt das Fehlen solcher Bewegungen.
4. Der wichtigste Aspekt der Verhaltensanalyse und in der Regel die größte Quelle der Variabilität zwischen den Beobachtern in der FST ist die korrekte Identifizierung von Bewegungen, die als bona fide Mobilität gezählt werden. Unsere operationale Definition für die Mobilität in der FST ist jede Bewegung, die nicht notwendig, um die Körperbalance und halten den Kopf über dem Wasser ⁴. Mäuse in der Regel schwimmen in Wasser leicht, aber sie noch manifest kleine Bewegungen, ihren Körper Gleichgewicht und halten ihre Köpfe über dem Wasser. Diese Verhaltensweisen sind kein Versuch, zu entkommen und sollte nicht als Mobilität erzielt werden. Auch nach einem Anfall von Mobilität, auch wenn im wesentlichen unbeweglich, können Mäuse noch im Wasser treiben als Folge der Dynamik. Diese Bewegungen sollten auch nicht als Mobilität erzielt werden.
5. In unserem Labor verwenden wir ein On-Screen-Stoppuhr-Software (XNote Stoppuhr, dnSoft Research Group) für Zeitmessungen. Zwei getrennte Stoppuhren werden auf dem Bildschirm verwendet. Die erste Stoppuhr zählt von 240 Sekunden und warnt den Betrachter, wenn die Verhaltensanalyse endet. Die zweite Stoppuhr misst die Zeit mobil. Einige Stoppuhr-Software hat die Fähigkeit, Schlüssel zuordnen zu starten und zu stoppen Funktionen, so dass auf dem Bildschirm Stoppuhren von der Tastatur gesteuert werden kann. In unserem Labor statt einer normalen Tastatur, verwenden wir ein Eingabegerät allgemein bekannt alsa 'Gamepad', um den Stoppuhren zu kontrollieren.
6. Bei Verwendung eines PC zur Unbeweglichkeit zu quantifizieren, wenn es mehr als eine Maus getestet und auf dem Bildschirm, ist es eine gute Idee, die anderen Tiere decken (man kann ein anderes Programm-Fenster verwenden oder körperlich Abdeckung des Bildschirms mit Papier), so dass ihre Bewegungen werden nicht davon ablenken, den Betrachter.
7. Wenn ein On-Screen-Stoppuhr verwendet wird, sicher sein, alle, aber die Millisekunde Dezimalstellen der Stoppuhr zu decken. Der Grund dafür ist, um Verzerrungen in den Beobachter zu verhindern, solange noch die Möglichkeit, festzustellen, ob die Uhr läuft oder nicht läuft. Da der Beobachter, während blind für die Gruppenzugehörigkeit der Tiere, eine allgemeine Vorstellung von Maß an Mobilität bei den Mäusen haben wird, kann es eine gewisse Tendenz auftritt, wenn sie erlaubt ist, um den Gesamtbetrag der Mobilität Zeitpunkt für das betreffende Maus vergangen zu sehen vor Abschluss der Analyse-Sitzung. Durch die Abdeckung der Stoppuhr, wird sie nur wissen, ob die Stoppuhr-oder ausgeschaltet ist an jedem Punkt, aber will nicht wissen, die insgesamt verstrichene Zeit und kann daher nicht von einer Voreingenommenheit erfolgen.
8. Ein inter-Reliabilität Test sollte für jeden neuen Beobachter durchgeführt werden, bevor Daten von Versuchstieren zu sammeln. In unserem Labor, jedes neue Beobachter ersten Uhren ein erfahrener Beobachter Scoring. Nach den neuen Beobachter gewinnt Vertrauen, um die Mobilität von Unbeweglichkeit zu unterscheiden, sie dann Partitur mit dem erfahrenen Beobachter beobachten und darauf hingewiesen Fehler. Sobald diese Phase erfolgreich abgeschlossen ist, wird die neue Beobachter analysieren eine bestimmte Gruppe von FST Videos, die wir halten in unserem Labor für Schulungszwecke. Erst nach ein hohes Maß an inter-observer Korrelation mit dem erfahrenen Beobachter erhält nicht einen Ermittler mit der Analyse FST Videos in realen Experimenten. Wir archivieren die Daten aus diesen Trainings-Analysen auf einen internen Standard für das Labor für die zukünftige Verwendung darstellen. Wir haben Unterschiede zwischen den Stämmen in der Art und Weise, in der sie ausdrücken mobi beobachtetkeit (und Unbeweglichkeit) Verhalten und meine Unbeweglichkeit Zeit zwischen den Geschlechtern. Wenn ein neuer Stamm, Geschlecht oder genetisch veränderte Maus-Modell im Labor getestet wird, ist es notwendig, wieder verpflichten diese Art der Zuverlässigkeitsanalyse.

4. Repräsentative Ergebnisse

Es gibt deutliche Unterschiede zwischen genetisch verschiedenen Inzucht-und outbred Mausstämme in Bezug auf ihre Grundlinie Unbeweglichkeit und die Reaktion auf ein bestimmtes Medikament ^5-11. Zum Beispiel haben wir festgestellt, Differential Antidepressiva-ähnliche Reaktionen auf Lithium in einem Panel von Mausstämmen (Abbildung 1) ^5. Experimentelle Einzelheiten dieses Experiments sind in Can et al., 2011 ⁵ veröffentlicht.

Abbildung 1. Immobilität Zeit (in Sekunden) in die Forced Swim Test, fünf Stunden nach einer einzigen ip Injektion von Kochsalzlösung, 200, 300 oder 400 mg / kg in verschiedenen Inzucht-und outbred Mausstämme. *: P <0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001 bezeichnen einen signifikanten Unterschied im Vergleich zu Kochsalzlösung Gruppe, Dunnett-post-hoc Test. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Anzahl der Tiere pro Gruppe für jeden Stamm ist 6-8 (Abbildung aus ⁵ wiedergegeben).

Nicht alle Mausstämme eignen sich für die FST. Einige Stämme, wie Black Swiss, NIH Swiss und FVB / NJ zeigen wenig oder fast keine Unbeweglichkeit unter Kontrollbedingungen, bietet einen Boden-Effekt (Abbildung 1) ^5. Das Fehlen von Baseline Unbeweglichkeit verhindert wirkungsvoll Nachweis einer antidepressiven Wirkung der experimentellen Manipulationen. Es ist auch möglich, während sehr selten, dass einige Maus-Stämme können abweichend verhalten und tauchen Sie ein in den Tank während des Tests, obwohl sie schwimmen können. Ein solcher Stamm ist DBA/1OlaHsd (unveröffentlichte Beobachtung in unserem Labor). Solche Stämme sind nicht geeignet für die FST. Aus diesem Grund tauchen Risiko jedoch small, beim Testen einer neuen Sorte, die nicht zuvor in den FST oder eine Maus beherbergt eine neuartige genetische Manipulation getestet, ist es unerlässlich, genau zu beobachten die ersten Versuche an Mäusen zu retten, wenn sie in potenziell schädliche Verhaltensweisen zu engagieren.

In der experimentellen Design hier beschriebenen, mehrere Tiere (bis zu fünf) sind zur gleichen Zeit getestet. Während die Teiler verwenden wir verhindern Mäuse einander sehen, während des Tests und die weiße Rauschen wird unterdrückt hörbare Laute, hat unser Set-up nicht verhindern, dass alle Ultraschall-oder Geruchssinn aus übertragen werden. Obwohl unwahrscheinlich, dass die Art der Prüfung gegeben, könnten diese beeinflussen das Verhalten von Mäusen. Eine Lösung für dieses Problem wäre es, die Tiere einzeln zu testen. Allerdings hat dieser Ansatz seine eigenen Probleme. Zum Beispiel, allgemein, die Tiere in jeder Session geprüft von der gleichen homecage kommen. Dies ermöglicht Randomisierung und ein Gegengewicht zu der experimentellen Variablen. Testing Mäusen einzelnenly würde bedeuten, eine Maus zu einer Zeit, aus der homecage. Dies führt dazu, wiederholt Stress und Störungen der sozialen Hierarchie in den Käfig unter den anderen hinter sich gelassen. Ein weiteres Problem mit der Prüfung einzeln sind die zeitlichen Beschränkungen. Testen einer Maus zu einer Zeit, wird das Experiment in vielen Stunden was zu einer Situation, in der Mäuse zu verschiedenen Zeiten des zirkadianen Zyklus getestet werden zu erweitern. Dies kann zu verwechseln Tageszeit Effekte. Die Forscher sollten diesen Fragen im Hinterkopf behalten, während der Gestaltung ihrer Experimente.

Diskussion

Der FST (manchmal auch als Porsolt Swim Test) wurde erstmals für Ratten entwickelt und dann für Mäuse durch Porsolt und Kollegen ^12,13 modifiziert. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Protokoll erfolgreich in unserem Labor haben eine Reihe von weitgehend subtilen Test Modifikationen veröffentlicht worden (siehe HASCOET und Bourin für eine vollständige Überprüfung ^1). Es ist ein verbreiteter Test zur Beurteilung der Wirksamkeit von Antidepressiva und die Auswirkungen verschiedener Verhalte...

Materialien