עכבר בכפייה לשחות מבחן

Summary

המבחן הוא נאלץ לשחות תוקף כגישה הניסוי להעריך את יעילות נגד דיכאון פוטנציאל במכרסמים. חיות הניסוי ממוקמות בתוך טנק מים לברוח בנושא התנהגות ניידות לכימות. הנהלים משותף לגרסה העכבר של מבחן זה מתוארים.

Abstract

המבחן נאלץ לשחות הוא מבחן התנהגותי מכרסם המשמש להערכה של תרופות נוגדות דיכאון, נוגדות דיכאון יעילות של תרכובות חדשות, ומניפולציות הניסוי מכוונים טיוח או מניעת דיכאון, כמו מדינות. עכברים ממוקמים מיכל שקוף שאין מנוס ממנו כי הוא מלא מים הקשורים בריחתם התנהגות ניידות נמדד. המבחן נאלץ לשחות היא פשוטה לנהל אמין זה דורש ציוד מיוחד מינימלית. יישום מוצלח של הבדיקה נאלץ לשחות דורש דבקות פרטים פרוצדורליים מסוימים וצמצום מתח מוצדקת על עכברים. בתיאור פרוטוקול הווידאו הנלווה, נסביר כיצד לנהל את הגרסה העכבר של מבחן זה, עם דגש על בעיות פוטנציאליות שעלולות להזיק הפרשנות של התוצאות וכיצד להימנע מהם. בנוסף, אנו מסבירים כיצד התנהגויות לידי ביטוי במבחן מוערכים.

Protocol

1. חומרים ושיטות

1.1. המים טנקים

הטנקים גלילי (30 ס"מ גובה 20 ס"מ קוטר) נדרש מבחן נאלץ לשחות העכבר (FST) במעבדה שלנו בנויים על פרספקס שקוף, חומר זה הוא מסוגל לעמוד תנועת תכופים של טנקים בתאונות יותר מאשר זכוכית. מפלס המים הוא 15 ס"מ מלמטה ו - צריך להיות מסומן על הטנק על מנת להבטיח כי נפח המים הוא עקבי על פני עכברים. מספר טנקים אידיאלי צריך להיות לפחות כפליים ממספר העכברים נבדק בכל פעם, כך הסט השני מיכל המים יכול להיות מלא בזמן הסט הראשון נמצא בשימוש. מידות הטנקים יש לבחור באופן העכברים לא יוכלו לגעת התחתון של הטנק, או ברגליהם או בזנבם, במהלך הבדיקה שחייה. גובה המיכל צריך להיות גבוה מספיק כדי למנוע את העכברים לברוח מהטנק. שים לבכי הקוטר של הטנק ואת עומק המים הם פרמטרים חשובים כי יכול להיות מותאם כדי לשנות את ההתנהגות של עכברים (לניתוח מפורט של הנושאים האלה לראות ^1-3).

1.2. מדחום

עמיד במים מדחום אינפרא אדום עדיפה, שכן מדידה מהירה של הטמפרטורה מפחיתה את כמות הזמן הנדרש לבצע את הבדיקה. עם זאת, מדחום כספית מזכוכית יהיה גם מספיק למשימה זו.

1.3. שעון עצר

1.4. מכשיר הקלטת וידאו

אנו משתמשים במצלמת וידאו נתמך על ידי חצובה. מאז בדיקה זו בדרך כלל בעלי חיים רבים נבדק באותו הזמן, הבקיע חיים יהיה קשה מאוד לא מומלץ. מצלמת וידאו צריך להקליט ברזולוציה גבוהה מספיק כדי לעבד תמונה איכותי אשר ישמש מאוחר יותר הבקיע התנהגותיות. תמיד לוודא שיש מספיק זיכרון הקלטה של ​​המצלמה לפני שהתחילגרם הבדיקה. אנו משתמשים במצלמת וידאו דיגיטלית אשר רשומות ללא שימוש בתקשורת מכני (כלומר קלטת וידאו), המאפשר העברת וידאו דיגיטלי. אם יש השתקפויות יתר על הטנקים, אשר עלולה להתרחש בסביבות מעבדה עם תאורה פלורסנט מעל הראש, מומלץ להשתמש במסנן מקטב עם עדשת המצלמה שלך.

1.5. מחוגה

במעבדה שלנו יש לנו שני סטים של חוצצים (35 ס"מ גובה 22 ס"מ רוחב 22 ס"מ עומק). אלו מלבני עם שלושה קירות משמשים כרקע וגם כמו חוצצים בין הטנקים כדי למנוע עכברים מלראות אחד את השני במהלך הבדיקה ואפשרות לשנות את ההתנהגות שלהם. קבוצה אחת יכולה להיות בצבע שחור עבור בעלי חיים לבקנים ואור: להגדיר אחרים יכולים להיות אור צבעוני לבעלי חיים בצבע כהה כדי להבהיר ניגודיות גבוהה. הנסיין צריך לוודא כי פני השטח של חוצצים אינם משקפים יותר מדי, כך שהם משנים תמונות מצלמה, או להבהיר ברה מז'ורifferences בין רמות התאורה.

1.6. מחולל רעש לבן

זה נחוץ בסביבות מעבדה שבה רעשים פתאומיים ניתן לשמוע כי היה פוטנציאל לזעזע את החיות. מחולל רעש יהיה מסכה כזו נשמע מטריד לסירוגין. רמת עוצמת הקול של מחולל רעש לבן יש לבחור להיות מעל רעשי הסביבה בלתי צפויה אחרת. בחדר הניסוי שלנו על רמת רעש הסביבה (ללא מחולל רעש לבן מופעל) הוא 60 dB. רמת הרעש הכוללת עם מחולל רעש לבן מופעל במקום שבו מוצבים הטנקים הוא 70-72 דציבל. עם זאת, יש לציין כי נתונים אלה ניתנים כדוגמה בלבד, כל מעבדה צריך לבחור את רמות הרעש הנכון לפי הסביבה הייחודית שלהם ואת הנסיבות.

1.7. נייר ייבוש ואת מנורת חום

לפני החזרת בעלי חיים בכלובים בביתם, חשוב לייבשאותם בעדינות בעזרת מגבות נייר כדאי להשתמש מנורת חום (להיות בטוח הטמפרטורה החשיפה אינו עולה על 32 ° C) כדי למנוע היפותרמיה.

2. נוהלי ההתנהגות

1. עיצוב ניסיוני הכולל צריך לשקף מאזנת כראוי בין משתנים ספציפיים הניסוי. לדוגמה, בניסויים שלנו, אנו מנסים לייצג כל קבוצה שווה כל פגישה FST (כלומר, אם יש ארבע קבוצות הטיפול, כל אחד יהיה מיוצג בכל פגישה). כמו כן, העכברים הם מסובבים, כגון עכברים מכל קבוצת טיפול ממוקמים טנק שונה בכל פגישה.
2. מניחים את המצלמה ואת חוצצים בעמדה. המצלמה צריכה להיות קרוב ככל האפשר על מנת לקבל את הרזולוציה הגבוהה ביותר של העכברים.
3. הטנקים צריכים להיות מלאים במי ברז להגדיר בטמפרטורת החדר (23-25 ​​° C) לרמה נחוש, אשר מסומן על קירות המיכל. אם המתקן שלך אין ווא חם / קר מתמידter, מומלץ להכין מים חמים ו / או קרח כדי להביא במהירות את המים לטמפרטורה הנכונה. בדוק את טמפרטורת המים עם מדחום אינפרא אדום. לחילופין, אם הטמפרטורה של מים חמים וקרים קבועים במתקן שלך, אתה יכול לצייר על הטנק שני סימנים - אחד ברמה של מים חמים סימן השנייה תוספת של מים קרים - להתקרב הסופי הנכון טמפרטורת המים במהירות.
4. הפעל את מחולל רעש לבן, אם בשימוש, לפני העכברים הם הציגו לחדר הבדיקה. רמת רעש לבן צריך רק להיות מספיק כדי להסוות רעשים חיצוניים. הימנע נפח גבוה ולוודא את אותה רמת רעש לבן נמצא בשימוש עבור כל בעלי החיים.
5. תביאו את החיות לחדר הבדיקה. אם החדר שבו המושבה החיות לשכון וחדר בדיקות סמוכים או קרוב מאוד אחד את השני, את תנאי הסביבה דומים לבין הפרעה במהלך העברת הכלוב הוא מינימלי, אז לא הסתגלות פריod יהיה צורך. אחרת, במקום החיות בחדר הבדיקה לתקופה של הסתגלות (בדרך כלל לפחות שעה אחת). אם תקופת ההסתגלות יש צורך, לוודא את החיות acclimated לא יושפעו על ידי עכברים נבדק באותו זמן באותו חדר. לידיעתך רמזים הריח ואת קולי ניתן חש ידי בעלי חיים אחרים ממוקמים באותו חדר.
6. התחל הקלטת וידאו לפני הצבת את החיות לתוך מיכלי מים.
7. החזיקו את החיה בזנבו, בעדינות ולאט לאט המקום במים. לאחר העכברים הוא במים, לאט לשחרר את הזנב. בדרך כלל, באמצעות הליך זה ימנע את הראש של החיה מלהיות שקוע מתחת למים.
8. מניחים את העכברים הטנקים כדי שבו חסימה של ההקלטה יהיה ממוזער. צו זה, כמובן, צריך להיות החליטו בשיתוף עם מקזז של קבוצות אחרות ודרישות ספציפיות לתכנון הניסוי שלך.
9. לאחר כל העכברים נמצאים הספירה לאחור את הטנקים, להתחיל את שעון העצר. אורך המבחן הרגיל של העכברים זה שש דקות בתוך FST.
10. במהלך הבדיקה להיות בטוח שאתה במרחק סביר מן החי, ולא עושים שום תנועה או רעש שעלול להיות לב על ידי בעלי החיים. עכברים יכולים בקלות לצוף במים, לעומת זאת, אם גם זן חדש של עכברים או תרכובת חדשה למבחן בלי ידע קודם השפעתם על התנהגות שחייה, הנסיין צריך לפקח על בעלי חיים יותר מקרוב. לעומת חולדות, עכברים בדרך כלל לא לצלול במהלך FST, אולם במקרה של צלילה העכבר יש להסיר מהטנק. אם הנסיין עוזב את החדר העכברים צריכים להיות במעקב וידאו במקרה של עכבר לא יכול לשמור על שחייה צף התנהגות להפסיק את הבדיקה אם יש צורך.
11. בתום תקופה של שש בדיקות דקה לעצור את ההקלטה. במעבדה שלנו, אנו מראים פתק מול המצלמה שמזהה את החיות ממש בסוףהקלטה של ​​כל אחד. כאשר משתמשים בגישה זו הפרט לאחר מכן הבקיע את ההקלטה לא תדע את זהות בעלי חיים מאז זהות מוצגת רק ממש בסוף ההקלטה. זה מונע כל זיהוי רישומים הבעיות שעלולות להתעורר מאוחר יותר הקשורים ההקלטות. ללא קשר לאסטרטגיה רישומים אשר נמצא בשימוש, הוא צריך לזהות בבירור את החיות וגם למנוע את הפרט לאחר מכן הבקיע את המבחן מהצורך בידע של משימות קבוצתיות.
12. הסר את החיות מן המים על ידי הזנבות שלהם באותו סדר שאתה לשים אותם בעדינות יבש אותם עם נייר ייבוש המקום בחזרה homecage שלהם.

3. ניתוח התנהגות

1. הגרסה העכבר של FST הוא בדרך כלל, מתחילתו ועד סופו, שש דקות ארוכות. עם זאת, בדרך כלל רק ארבע דקות האחרונות של המבחן מנותחים. זאת בשל העובדה שרוב העכברים פעילים מאוד בתחילת FST, ועל pתופעות otential הטיפול יכול להיות מוסתר במשך שתי דקות קודם.
2. במעבדה שלנו, אנו להעלות את קבצי וידאו ישירות מהמצלמה למחשב ולעשות את הניתוח במחשב.
3. במהלך ניתוח התנהגותי, זמן מבלה כל אחד כי עכברים ניידים נמדד. הסכום הכולל של זמן ניידות מופחת אז מן 240 שניות של זמן הבדיקה נאמר אז הזמן תנועה. אמנם זה אפשרי למדוד את הזמן תנועה ישירות, במעבדה שלנו מצאנו את זה יותר קל לזהות ולמדוד תנועות פעיל ולא חוסר תנועות כאלה.
4. ההיבט החשוב ביותר של ניתוח התנהגותי ובדרך כלל המקור הגדול ביותר של השתנות בין משקיפים FST הוא זיהוי נכון של תנועות נחשבים ניידות בתום לב. ההגדרה התפעולית שלנו על הניידות FST הוא כל תנועות אחרות מאלה הדרושים כדי לאזן את הגוף ולשמור את הראש מעל המים ⁴. עכברים בדרך כלל לצוף במים בקלות, אך הם עדיין לידי ביטוי בתנועות קטנות כדי לאזן את גופם ולשמור את הראש מעל המים. התנהגויות אלו אינן ניסיון לברוח לא צריך להיות קלע כמו ניידות. כמו כן, לאחר התקף בודד של ניידות, למרות נייח למעשה, עכברים עדיין יכול להיסחף במים כתוצאה תאוצה. תנועות אלו גם לא צריך להיות קלע כמו ניידות.
5. במעבדה שלנו, אנו משתמשים על המסך שעון עצר תוכנה (Xnote סטופר, dnSoft קבוצת המחקר) עבור מדידות זמן. שני סטופרים נפרד משמשים על המסך. סטופר first ספירות למטה 240 שניות והתראות הצופה כאשר תקופת ניתוח התנהגותי מסתיים. סטופר second אמצעים הזמן המושקע ניידים. כמה תוכנות סטופר יש את היכולת להקצות מקשים כדי להתחיל ולהפסיק פונקציות, כך שעל המסך סטופרים יכול להיות נשלט על ידי המקלדת. במעבדה שלנו, במקום מקלדת רגילה, אנו משתמשים התקן קלט הידוע בכינויו"Gamepad" לשלוט סטופרים.
6. בעת שימוש במחשב לכמת תנועה, אם יש יותר מאחד העכבר נבדק להציג על המסך, זה רעיון טוב כדי לכסות את חיות אחרות (אתה יכול להשתמש עוד חלון התוכנית או פיזית לכסות את המסך עם נייר), כך התנועות שלהם לא להסיח את דעתו של הצופה.
7. אם על המסך שעון עצר משמש, להיות בטוח כדי לכסות את כל אבל עשרוניות אלפית שנייה של שעון העצר. הסיבה לכך היא למנוע הטיה הצופה, תוך מתן יכולת לקבוע אם השעון פועל או לא פועל. מאז הצופה, בעוד עיוור מטלות קבוצה של בעלי החיים, יהיה מושג כללי על רמת הניידות בעכברים, ייתכן שיש כמה הטיה המתרחשים אם היא מותרת כדי לראות את הסכום הכולל של הזמן שחלף ניידות עבור העכבר המסוים לפני סיום הפגישה ניתוח. על ידי כיסוי סטופר, היא רק לדעת אם שעון העצר מופעל או מבוטל בכל נקודה אבל wilאני לא יודע את סך כל הזמן שחלף, ולכן לא יכול להתבצע על ידי הטיה כלשהי.
8. בין הצופה אמינות הבדיקה צריכה להתנהל עבור כל משקיף חדש לפני תחילת לאסוף נתונים מבעלי חיים מבחן. במעבדה שלנו, כל משקיף החדש הראשון שעונים הבקיע משקיף מנוסה. לאחר אמון צופה רווחי חדש להבדיל מן ניידות תנועה, אז הם ציון עם משקיף מנוסה צופים להצביע טעויות. לאחר שלב זה מסתיים בהצלחה, הצופה החדש יהיה לנתח סדרה ספציפית של קטעי וידאו FST שנשמור במעבדה שלנו למטרות אימונים. רק לאחר רמה גבוהה של התאמה בין הצופה מתקבל עם הצופה המנוסה עושה החוקר להתחיל בניתוח קטעי וידאו FST בניסויים בפועל. אנחנו בארכיון נתונים אלה מנתח הכשרה מהווה תקן פנימי במעבדה לשימוש עתידי. ראינו הבדלים בין זני באופן שבו הם מביעים mobi(וגם חוסר תנועה) lity התנהגויות, וזמן תנועה ממוצע בין המינים. כאשר מודל חדש זן, מין, או מהונדסים גנטית העכבר נבדק במעבדה יש ​​צורך שוב לבצע סוג זה של ניתוח אמינות.

4. נציג תוצאות

ישנם הבדלים ברורים בין מסומן גנטית זנים טהורים העכבר ו outbred במונחים של תנועה בסיסית שלהם להגיב תרופה ספציפית ^5-11. כך, למשל, זיהינו ההפרש נוגדות דיכאון כמו ליתיום התגובות בהרכב של זנים העכבר (איור 1) ^5. פרטים ניסויית של ניסוי זה מתפרסמים יכול et al. 2011 ^5.

באיור 1. חוסר התנועה זמן (בשניות) במבחן נאלץ לשחות, חמש שעות לאחר ההזרקה IP יחידה של מלח, 200, 300, או 400 מ"ג / ק"ג של נישואי קרובים שונים outbred זנים העכבר. * P <0.05, **: p <0.01, ***: p <0.001 לציין הבדל משמעותי בהשוואה לקבוצת מלוחים, מבחן post hoc של Dunnett. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. מספר בעלי חיים לכל קבוצה עבור כל זן הוא 6-8 (איור לשכפל מתוך ^5).

לא כל זני עכבר מתאימים FST. כמה זנים, כגון שחור השוויצרי, NIH שוויצרי, FVB / NJ להראות מעט או כמעט ללא תנועה בתנאים שליטה, ולכן המייצגים אפקט הרצפה (איור 1) ^5. חוסר תנועה בסיסית ביעילות מונע גילוי ההשפעה האנטי דיכאונית של מניפולציות ניסיוני. אפשר גם, בעוד נדיר מאוד, כי כמה זנים העכבר עשוי להתנהג aberrantly ולצלול לתוך הטנק במהלך הבדיקה, למרות שהם יכולים לצוף. אחת כזו היא זן DBA/1OlaHsd (תצפית פורסם במעבדה שלנו). זנים אלו אינם מתאימים FST. בשל הסיכון הזה צלילה, אולם smalאני, כאשר בדיקות זן חדש שלא נבדק בעבר FST או עכבר מחסה מניפולציה גנטית רומן, זה הכרחי כדי לשמור בקפדנות את הניסויים הראשוניים להציל עכברים אם הם התנהגויות מזיקים.

בתכנון הניסוי המתואר כאן, חיים מרובים (עד חמישה) נבחנים באותו זמן. בעוד חוצצים אנו משתמשים בעכברים למנוע מלראות אחד את השני במהלך הבדיקה, ואת מחולל רעש לבן מדכא קולות נשמע שלנו, הגדרת אינה מונעת כל רמזים קוליים או הריח של משודרים. למרות נתון סביר את מהות הבדיקה, אלה יכול להשפיע על התנהגויות של עכברים. פתרון אחד לבעיה זו יהיה לבדוק את החיות בנפרד. עם זאת, גישה זו יש בעיות משלה. לדוגמה, בדרך כלל, בעלי חיים נבדק בכל פגישה באים homecage זהה. זה מאפשר אקראיות ומאזן של המשתנים ניסיוני. בדיקת הפרט עכבריםly פירושה הסרת עכבר אחת בכל פעם מן homecage. זה יגרום ללחץ חוזרות הפרעה של ההיררכיה החברתית בכלוב בין היתר נותרו מאחור. סוגיה נוספת עם בדיקות ביחידים הם אילוצי זמן. בדיקה עכבר אחת בכל פעם תרחיב את הניסוי תוך שעות רבות וכתוצאה מכך למצב שבו עכברים נבדקים בזמנים שונים של מחזור היממה. זה עלול ליצור בלבול זמן של תופעות יום. החוקרים צריכים לשמור על בעיות אלה בחשבון בעת ​​תכנון הניסויים שלהם.

Discussion

FST (המכונה לעתים מבחן לשחות Porsolt) פותח לראשונה עבור חולדות שונה אז עבור העכברים על ידי Porsolt ועמיתיו ^12,13. בנוסף פרוטוקול המתואר לעיל המוצלח במעבדה שלנו, מספר שינויים בעיקר מבחן עדין פורסמו (ראה Hascoët ו Bourin לסקירה מלאה ^1). זהו מבחן הנפוצות להערכת היעילות של תרופו...

Materials