La forzata mouse test Swim

Riepilogo

Il test di nuoto forzato è convalidato come un approccio sperimentale per valutare il potenziale efficacia antidepressiva nei roditori. Animali da laboratorio sono collocati in una vasca di acqua e fuga comportamento relativo alla mobilità è quantificato. Le procedure comuni per la versione del mouse di questa prova sono descritti.

Abstract

Il test di nuoto forzato è un test comportamentale roditori utilizzati per la valutazione dei farmaci antidepressivi, efficacia antidepressiva di nuovi composti, e le manipolazioni sperimentali che mirano a rendere o prevenire gli stati depressivi simile. I topi sono posti in una vasca trasparente inevitabile che si riempie con l'acqua e il loro comportamento mobilità fuga relativo è misurato. Il test di nuoto forzato è semplice da effettuare in modo affidabile e che richiede minime attrezzature specializzate. Il successo del test di nuoto forzato richiede l'osservanza di determinati dettagli procedurali e ridurre al minimo lo stress ingiustificato per i topi. Nella descrizione del protocollo e il video di accompagnamento, spieghiamo come condurre la versione del mouse di questo test con particolare attenzione ai trabocchetti potenziali che possono essere pregiudizievoli per l'interpretazione dei risultati e come evitarli. Inoltre, abbiamo spiegato come i comportamenti manifestati nel test sono valutati.

Protocollo

1. Materiali e metodi

1.1. Il serbatoi d'acqua

I serbatoi cilindrici (30 cm di altezza x 20 diametro cm) necessari per il test del nuoto forzato (FST) nel nostro laboratorio sono realizzati in plexiglas trasparente, in quanto questo materiale è in grado di resistere alle frequenti spostamenti dei carri armati e gli incidenti meglio di vetro. Il livello dell'acqua è di 15 cm dal fondo e deve essere segnato sul serbatoio per assicurare che il volume di acqua è coerente tra i topi. Il numero di carri armati dovrebbe idealmente essere almeno il doppio rispetto al numero di topi in fase di test alla volta, in modo che il secondo set serbatoio può essere riempito mentre il primo set è in uso. Le dimensioni dei serbatoi deve essere scelto in modo che i topi non sarà in grado di toccare il fondo della vasca, sia con i piedi o la coda, durante la prova di nuoto. L'altezza del serbatoio dovrebbe essere abbastanza alta da evitare che i topi di uscire dalla vasca. Si prega di notareche il diametro del serbatoio e la profondità d'acqua sono parametri importanti che possono essere regolati per modificare il comportamento dei topi (per un'analisi dettagliata di questi temi vedi ^1-3).

1.2. Termometro

Un termometro a infrarossi resistente all'acqua è preferibile, dal momento che la misurazione rapida della temperatura riduce la quantità di tempo necessario per effettuare il test. Tuttavia, un termometro di vetro a mercurio saranno sufficienti per questo compito.

1.3. Timer

1.4. Dispositivo di registrazione video

Noi usiamo una videocamera sostenuto da un treppiede. Poiché questo test di solito comporta animali più in fase di sperimentazione allo stesso tempo, segnando dal vivo sarà molto difficile e non è consigliabile. La videocamera dovrebbe registrare in alta risoluzione basta per rendere un'immagine di qualità che verrà usata in seguito per il punteggio comportamentali. Assicurarsi sempre che vi sia memoria sufficiente a registrare la fotocamera prima di starting il test. Noi usiamo una videocamera che registra in digitale senza l'utilizzo di mezzi meccanici (cioè videocassetta), consentendo il trasferimento digitale di video. Se ci sono riflessioni eccessive sui carri armati, che possono verificarsi in ambienti di laboratorio con un sovraccarico di illuminazione fluorescente, si consiglia di utilizzare un filtro lente polarizzante con la fotocamera.

1.5. Divisori

Nel nostro laboratorio abbiamo due serie di divisori (35 cm di altezza x 22 cm di larghezza x 22 cm di profondità). Queste sono rettangolari con tre pareti e vengono utilizzati sia come sfondo e come divisori tra serbatoi per evitare che i topi da vedersi durante il test e potenzialmente alterare i loro comportamenti. Un gruppo può essere di colore nero per gli animali albini e la luce, l'altro gruppo può essere di colore chiaro per gli animali di colore scuro per rendere ad alto contrasto. Lo sperimentatore deve assicurarsi che le superfici dei divisori non sono eccessivamente riflettente in modo da alterare le immagini della videocamera, o rendere maggiore differences tra i livelli di illuminazione.

1.6. Generatore di rumore bianco

Ciò è necessario in ambienti di laboratorio, in cui improvvisi rumori forti può essere sentito che potenzialmente spaventare gli animali. Il generatore di rumore si maschera come i suoni intermittenti inquietante. Il livello del volume del generatore di rumore bianco dovrebbero essere selezionati per essere al di sopra di altri rumori ambientali e inaspettato. Nella nostra stanza sperimentale il livello di rumore ambientale (senza il generatore di rumore bianco attivato) è di 60 dB. Il livello di rumore totale con il generatore di rumore bianco attivato nel punto in cui sono collocati i serbatoi è 70-72 dB. Tuttavia va notato che queste cifre sono forniti come esempio solo, e ogni laboratorio dovrebbe selezionare i livelli di rumore diritto in base al loro ambiente unico e le circostanze.

1.7. Carta asciugatura e lampada di calore

Prima di tornare gli animali nelle loro gabbie a casa, è importante asciugaredelicatamente con carta da cucina ed è utile usare una lampada di calore (la temperatura è certa esposizione non superi i 32 ° C) per evitare l'ipotermia.

2. Procedure comportamentali

1. Il design complessivo sperimentale dovrebbe riflettere controbilanciare adeguato tra variabili specifiche per l'esperimento. Per esempio, nei nostri esperimenti, cerchiamo di rappresentare ogni gruppo in modo uguale in ogni FST sessione (cioè, se ci sono quattro gruppi di trattamento, ognuno sarà rappresentata in ogni sessione). Inoltre, i topi vengono ruotati, in modo che i topi da ciascun gruppo di trattamento sono collocati in un diverso serbatoio in ogni sessione.
2. Collocare la fotocamera e i divisori in posizione. La fotocamera dovrebbe essere il più vicino possibile al fine di ottenere la massima risoluzione possibile dei topi.
3. I serbatoi devono essere riempiti con acqua di rubinetto fissato a temperatura ambiente (23-25 ​​° C) al livello determinato, che è segnato sulle pareti del serbatoio. Se la vostra struttura non ha costanti wa caldo / freddoter, si consiglia di preparare acqua calda e / o ghiaccio, per portare rapidamente l'acqua alla giusta temperatura. Controllare la temperatura dell'acqua con il termometro a raggi infrarossi. In alternativa, se le temperature di acqua calda e fredda sono costanti presso la vostra sede, è possibile disegnare sulla vasca due marchi - uno per il livello di acqua calda e un secondo segno per l'aggiunta di acqua fredda - per avvicinarsi alla finale corretta temperatura dell'acqua velocemente.
4. Avviare il generatore di rumore bianco, se utilizzato, prima che i topi vengono introdotti per la sala prove. Il livello di rumore bianco dovrebbe essere sufficiente per mascherare i rumori esterni. Evitare un alto volume e assicurarsi che lo stesso livello di rumore bianco viene utilizzato per tutti gli animali.
5. Portare gli animali in sala prove. Se la stanza colonia dove risiedono gli animali e la sala prove sono adiacenti o molto vicini tra loro, le condizioni ambientali sono simili e il disturbo durante la movimentazione della gabbia è minima, quindi non acclimatazione period sarà necessario. In caso contrario, luogo gli animali in sala prove per un periodo di acclimatazione (in genere almeno un'ora). Se un periodo di acclimatazione è necessario assicurarsi che gli animali acclimatati non saranno interessati dai topi in fase di sperimentazione allo stesso tempo nella stessa stanza. Si prega di essere consapevole del fatto che stimoli olfattivi e ad ultrasuoni può essere percepito da altri animali collocato nella stessa stanza.
6. Avviare la registrazione video prima di mettere gli animali nei serbatoi d'acqua.
7. Tenere l'animale per la coda, e delicatamente e lentamente posto in acqua. Una volta che il topo è in acqua, rilasciare lentamente la coda. Tipicamente, utilizzando questa procedura impedirà la testa dell'animale ad essere sommerso sotto l'acqua.
8. Mettere i topi nei serbatoi di un ordine in cui l'ostruzione della registrazione sarà ridotto al minimo. Questo ordine, naturalmente, dovrebbe essere decisa in collaborazione con il contrappeso di gruppi e altri requisiti specifici per il disegno sperimentale.
9. Una volta che tutti i topi sono nei serbatoi-avviare il conto alla rovescia sul cronometro. La lunghezza di prova usuale per i topi è di sei minuti nella FST.
10. Durante il test essere certi che sono ad una distanza ragionevole dagli animali e non fanno alcun movimento o rumore che può essere notato dagli animali. I topi possono facilmente galleggiare in acqua, tuttavia, se sia un nuovo ceppo di topi o di un nuovo composto in fase di sperimentazione, senza conoscenza del loro effetto sul comportamento di nuoto, lo sperimentatore dovrebbe monitorare più da vicino gli animali. A differenza di ratti, topi in genere non immergersi durante la FST, tuttavia in caso di immersioni con il mouse deve essere rimosso dal serbatoio. Se lo sperimentatore lascia la stanza i topi devono essere monitorati dal video nel caso in cui il mouse non può mantenere il nuoto e galleggianti comportamento e di interrompere il test se necessario.
11. Al termine del periodo di sei minuti di prova interrompere la registrazione. Nel nostro laboratorio, mostriamo una nota di fronte alla telecamera che identifica gli animali alla finedi ogni registrazione. Quando si utilizza questo approccio l'individuo successivamente segnando la registrazione non si conosce l'identità degli animali, dato che l'identità viene mostrato solo alla fine della registrazione. Questo impedisce qualsiasi identificazione e registrazione dei problemi che possono verificarsi in seguito relativi alle registrazioni. Indipendentemente dalla strategia di conservazione dei documenti che viene utilizzato, si dovrebbe identificare chiaramente gli animali e anche impedire l'individuo più tardi segnando la prova di avere conoscenza delle assegnazioni di gruppo.
12. Rimuovere gli animali dal mare per la coda nello stesso ordine che li metti dentro e asciugare delicatamente con carta di essiccazione e posto nuovamente dentro il loro homecage.

3. Analisi del comportamento

1. La versione del mouse di FST è tipicamente, dall'inizio alla fine, sei minuti. Tuttavia, in genere solo gli ultimi quattro minuti della prova vengono analizzati. Ciò è dovuto al fatto che la maggior parte dei mouse sono molto attivi all'inizio della FST, e il pSUFFICIENTI effetti del trattamento possono essere oscurata durante i primi due minuti.
2. Nel nostro laboratorio abbiamo caricare i file video direttamente dalla fotocamera al PC e fare l'analisi del PC.
3. Durante l'analisi comportamentale, il tempo che ogni topi spende mobile è misurata. L'importo totale del tempo la mobilità è poi sottratto i 240 secondi di tempo di prova e viene indicato come il tempo di immobilità. Mentre è possibile misurare il tempo di immobilità direttamente nel nostro laboratorio abbiamo trovato più facile da individuare e misurare i movimenti attivi, piuttosto che la mancanza di tali movimenti.
4. L'aspetto più importante di analisi comportamentale e di solito la principale fonte di variabilità tra osservatori nel FST è la corretta identificazione dei movimenti che sono considerati come la mobilità in buona fede. La nostra definizione operativa per la mobilità nel FST è un qualsiasi movimenti diversi da quelli necessari per bilanciare il corpo e tenere la testa sopra l'acqua ⁴. I topi di solito galleggiano in acqua facilmente, tuttavia esse tuttora esprimono piccoli movimenti di equilibrare i loro corpi e tenere la testa sopra l'acqua. Questi comportamenti non sono un tentativo di fuga e non deve essere segnata come la mobilità. Inoltre, dopo una sessione singola di mobilità, anche se sostanzialmente immobile, i topi sono ancora alla deriva in acqua a causa della quantità di moto. Questi movimenti non dovrebbe essere segnata come la mobilità.
5. Nel nostro laboratorio, si usa sullo schermo cronometro software (Xnote cronometro, dnSoft Research Group) per misure di tempo. Due cronometri separati utilizzati sullo schermo. La prima cronometro conto alla rovescia a partire da 240 secondi e avverte l'osservatore quando il periodo di analisi comportamentale finisce. Il secondo cronometro misura il tempo trascorso mobile. Alcuni software cronometro ha la capacità di assegnare tasti per avviare e interrompere le funzioni, in modo che sullo schermo cronometri può essere controllato tramite la tastiera. Nel nostro laboratorio, invece di una tastiera normale, si usa un dispositivo di input comunemente noto comeun 'gamepad' di controllare i cronometri.
6. Quando si utilizza un PC per quantificare immobilità, se c'è più di un topo testati e presenti sullo schermo, è una buona idea per coprire gli altri animali (si può usare un'altra finestra del programma o fisicamente coprire lo schermo con carta), in modo che i loro movimenti non distrarre l'osservatore.
7. Se sullo schermo cronometro viene utilizzato, essere certi di coprire tutti, ma i decimali millisecondo del cronometro. La ragione di questo è quello di evitare pregiudizi nell'osservatore, pur consentendo la possibilità di determinare se l'orologio è in esecuzione o non è in esecuzione. Dal momento che l'osservatore, mentre cieco alle assegnazioni di gruppo degli animali, avrà una idea generale del livello di mobilità nei topi, ci potrebbero essere alcuni pregiudizi che si verificano se si è permesso di vedere il tempo totale trascorso per la mobilità del mouse particolare prima del completamento della sessione di analisi. Coprendo il cronometro, ha solo sapere se il cronometro è acceso o spento in qualsiasi momento, ma will non conosce il tempo totale trascorso e, pertanto, non può essere effettuata da ogni pregiudizio.
8. Inter-osservatore test di affidabilità deve essere condotto per ogni nuovo osservatore prima di iniziare a raccogliere i dati provenienti da animali di prova. Nel nostro laboratorio, ciascun osservatore nuovi orologi prima un punteggio esperto osservatore. Dopo la nuova fiducia guadagni osservatore per differenziare mobilità da immobilità, hanno poi punteggio con l'osservatore esperto osservando e segnalando eventuali errori. Una volta che questa fase è completata con successo, il nuovo osservatore analizzerà uno specifico insieme di video FST che teniamo nel nostro laboratorio a scopo di addestramento. Solo dopo che un alto livello di inter-osservatore correlazione è ottenuta con l'osservatore esperto fa un investigatore inizia l'analisi video FST negli esperimenti reali. Noi archiviare i dati da queste analisi la formazione di costituire uno standard interno per il laboratorio per un uso futuro. Abbiamo osservato le differenze tra i ceppi nel modo in cui esprimono la mobilità (e immobilità) i comportamenti, e il tempo immobilità media tra i sessi. Quando un nuovo ceppo del mouse, il sesso, o geneticamente modificati modello viene testato in laboratorio, è necessario intraprendere questo nuovo tipo di analisi di affidabilità.

4. Rappresentante Risultati

Ci sono notevoli differenze tra diversi ceppi di topi geneticamente inbred e outbred in termini di immobilità basale e rispondere a un farmaco specifico ^5-11. Per esempio, abbiamo individuato differenziale antidepressivo-quali risposte a litio in un pannello di ceppi di topi (Figura 1) ^5. Dettagli sperimentali di questo esperimento sono stati pubblicati a Can et al., 2011 ^5.

Figura 1. Immobilità tempo (in secondi) nel test di nuoto forzato, cinque ore dopo una singola iniezione ip di soluzione salina, 200, 300, o 400 mg / kg nei vari inbred e outbred ceppi di topi. *: P <0,05, **: p <0.01, ***: p <0,001 denotano una differenza significativa rispetto al gruppo soluzione salina, test post hoc di Dunnett. I dati sono espressi come media ± SEM. Numero di animali per gruppo per ogni ceppo è 6-8 (Figura riprodotta da ^5).

Non tutti i ceppi di topi sono adatti per la FST. Alcuni ceppi, come Black svizzero, NIH svizzero e FVB / NJ mostrano poco o quasi immobilità in condizioni di controllo, e rappresenta quindi un effetto pavimento (Figura 1) ^5. La mancanza di immobilità al basale previene efficacemente rilevato un effetto antidepressivo di manipolazioni sperimentali. E 'anche possibile, benché molto rari, che alcuni ceppi di topi possono comportarsi in modo aberrante e tuffarsi nel serbatoio durante la prova, anche se possono galleggiare. Una tale pressione è DBA/1OlaHsd (osservazione inedita nel nostro laboratorio). Tali ceppi non sono adatti per la FST. A causa di questo rischio immersioni, però Small, quando si verifica un nuovo ceppo, che non è stato precedentemente testato in FST o un mouse ospitare una manipolazione genetica romanzo, è imperativo di osservare con attenzione le prove iniziali di salvare i topi se si impegnano in comportamenti potenzialmente dannosi.

Nel disegno sperimentale qui descritto, gli animali multipli (fino a cinque) sono testati al tempo stesso. Mentre i divisori che usiamo evitare i topi da vedersi durante la prova, e il generatore di rumore bianco sopprime vocalizzazioni udibili, il nostro set-up non impedisce tutte le indicazioni a ultrasuoni o olfattivi di essere trasmessi. Anche se improbabile, data la natura del test, questi potrebbero influenzare i comportamenti dei topi. Una soluzione a questo problema sarebbe quello di testare i singoli animali. Tuttavia, questo approccio ha i suoi problemi. Per esempio, comunemente, gli animali testati in ogni sessione provengono dalla homecage stesso. Ciò consente di randomizzazione e di controbilanciare le variabili sperimentali. Test individuali topiLy avrebbe significato la rimozione di un topo in un momento dal homecage. Questo farà sì che lo stress ripetuti e disturbi della gerarchia sociale nella gabbia tra gli altri lasciati alle spalle. Un altro problema con i test singolarmente sono i limiti di tempo. Test un mouse alla volta si estenderà l'esperimento in molte ore che provocano una situazione in cui vengono testati i topi in momenti diversi del ciclo circadiano. Questo può creare confusione volta di effetti giorno. I ricercatori dovrebbero tenere a mente questi temi durante la progettazione i loro esperimenti.

Discussione

La FST (a volte chiamato test nuotare Porsolt) è stato sviluppato prima per i ratti e poi modificato per topi da Porsolt e colleghi ^12,13. In aggiunta a quanto sopra-descritto il protocollo di successo nel nostro laboratorio, una serie di modifiche largamente prova sottili sono stati pubblicati (vedi Hascoet e Bourin per una revisione completa ^1). Si tratta di un test comunemente utilizzato per la valutazione dell'efficacia di farmaci anti-depressivi e gli effetti di varie manipolazioni compor...

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