Le test de natation forcée souris

Résumé

Le test de la nage forcée est validée comme une approche expérimentale pour évaluer le potentiel d'efficacité des antidépresseurs chez les rongeurs. Les animaux de laboratoire sont placés dans une cuve d'eau et d'évasion liés à des comportements de mobilité est quantifié. Les procédures communes pour la version la souris de ce test sont décrits.

Résumé

Le test de la nage forcée est un test de comportement chez les rongeurs utilisés pour l'évaluation des médicaments antidépresseurs, l'efficacité antidépressive de nouveaux composés, et des manipulations expérimentales qui visent à rendre ou à prévenir la dépression ressemblant à des États. Les souris sont placées dans un réservoir incontournable transparente qui est rempli avec de l'eau et leur comportement de mobilité liés échapper est mesurée. Le test de la nage forcée est simple à effectuer de façon fiable et qu'il requiert un minimum d'équipement spécialisé. Mise en œuvre réussie de l'épreuve de natation forcée exige l'adhésion à certains détails de procédure et la minimisation des contraintes injustifiées à la souris. Dans la description du protocole et de la vidéo qui l'accompagne, nous expliquons comment mener la version de ce test de la souris avec un accent sur les pièges potentiels qui peuvent être préjudiciables à l'interprétation des résultats et comment les éviter. En outre, nous expliquer comment les comportements se manifeste dans l'épreuve sont évalués.

Protocole

1. Matériels et Méthodes

1.1. Les réservoirs d'eau

Les réservoirs cylindriques (30 cm de hauteur x 20 cm diamètre) requis pour le test de natation de souris forcée (FST) dans notre laboratoire sont construits en plexiglas transparent, ce matériau est capable de résister aux mouvements fréquents des réservoirs et des accidents de mieux que le verre. Le niveau d'eau est de 15 cm du fond et doit être marqué sur le réservoir pour s'assurer que le volume d'eau est constante dans les souris. Le nombre de réservoirs devraient idéalement être d'au moins deux fois plus que le nombre de souris testées à la fois, de sorte que l'ensemble de l'eau du réservoir seconde peut être remplie tandis que la première série est en cours d'utilisation. Les dimensions des réservoirs doivent être sélectionnés d'une manière que la souris ne sera pas en mesure de toucher le fond de la cuve, soit avec leurs pieds ou leur queue, pendant le test de natation. La hauteur de la cuve doit être suffisamment élevé pour empêcher les souris de s'échapper de la cuve. S'il vous plaît noterque le diamètre du réservoir et la profondeur de l'eau sont des paramètres importants qui peuvent être ajustés pour changer le comportement de la souris (pour une analyse détaillée de ces questions, voir ^1-3).

1.2. Thermomètre

Un thermomètre à infrarouge résistant à l'eau est préférable, puisque la mesure rapide de la température réduit la quantité de temps nécessaire pour effectuer le test. Toutefois, un thermomètre en verre au mercure sera également suffisante pour cette tâche.

1.3. Minuterie

1.4. Dispositif d'enregistrement vidéo

Nous utilisons une caméra vidéo pris en charge par un trépied. Depuis ce test implique généralement plusieurs animaux testés dans le même temps, le pointage en direct sera très difficile et n'est pas souhaitable. La caméra vidéo doit consigner dans une résolution suffisamment élevée pour rendre une image de qualité qui seront utilisés plus tard pour la notation des comportements. Toujours s'assurer qu'il ya suffisamment de mémoire d'enregistrement dans l'appareil avant d'starting le test. Nous utilisons une caméra vidéo qui enregistre numériquement sans l'utilisation de moyens mécaniques (cassette vidéo par exemple), permettant le transfert numérique des vidéos. Si il ya des réflexions excessives sur les réservoirs, ce qui peut se produire dans des environnements de laboratoire avec un éclairage fluorescent frais généraux, vous pouvez utiliser un filtre polarisant avec votre lentille de caméra.

1.5. Diviseurs

Dans notre laboratoire, nous avons deux ensembles de diviseurs (35 cm de hauteur x 22 cm de largeur x profondeur 22 cm). Ce sont rectangulaires avec trois murs et sont utilisées comme fond et comme séparateurs entre les réservoirs pour empêcher les souris de voir les uns les autres pendant l'essai et éventuellement modifier leurs comportements. Un jeu peut être noir pour albinos et la lumière colorée des animaux; l'autre série peut être de couleur claire pour les sombres animaux colorés afin de rendre un contraste élevé. L'expérimentateur doit s'assurer que les surfaces des cloisons ne sont pas trop réfléchissante afin qu'ils modifient les images des caméras, ou rendre ré majeures différences entre les niveaux d'éclairement.

1.6. Générateur de bruit blanc

Ceci est nécessaire dans les environnements de laboratoire dans lequel bruits forts et soudains peuvent être entendues qui pourrait potentiellement effrayer les animaux. Le générateur de bruit, va masquer ces sons intermittents inquiétant. Le niveau du volume du générateur de bruit blanc devrait être choisi pour être au-dessus d'autres bruits ambiants et inattendue. Dans notre salle expérimentale du niveau de bruit ambiant (sans le générateur de bruit blanc est activé) est de 60 dB. Le niveau de bruit total avec le générateur de bruit blanc activé à l'endroit où les réservoirs sont placés soit 70 à 72 dB. Cependant il faut noter que ces chiffres sont fournis à titre d'exemple seulement, et chaque laboratoire doit sélectionner les niveaux de bruit à droite en fonction de leur environnement unique et des circonstances.

1.7. Séchage du papier et des lampes de la chaleur

Avant le retour des animaux dans leurs cages à domicile, il est important de sécherles délicatement à l'aide des serviettes en papier et il est utile d'utiliser une lampe chauffante (être certain que la température d'exposition ne dépasse pas 32 ° C) pour éviter l'hypothermie.

2. Procédures comportementales

1. La conception globale expérimentale devrait refléter contrepoids adéquat entre variables spécifiques à votre expérience. Par exemple, dans nos expériences, nous essayons de représenter chaque groupe également dans toutes les FST session (par exemple, si il ya quatre groupes de traitement, chacune sera représentée dans chaque session). En outre, les souris sont tournés, tels que les souris de chaque groupe de traitement sont placés dans un réservoir différent à chaque session.
2. Placer la caméra et les diviseurs en position. La caméra doit être aussi proche que possible afin d'obtenir la meilleure résolution possible de la souris.
3. Les réservoirs doivent être remplis avec de l'eau du robinet fixé à la température ambiante (23-25 ​​° C) au niveau déterminé, qui est marqué sur les parois du réservoir. Si votre établissement ne dispose pas constantes wa chaud / froidter, vous voudrez peut-être pour préparer l'eau chaude et / ou de glace pour amener rapidement l'eau à la bonne température. Vérifiez la température de l'eau avec un thermomètre infrarouge. Alternativement, si les températures d'eau chaude et froide sont constants dans votre établissement, vous pouvez dessiner sur le réservoir deux marques - un pour le niveau de l'eau chaude et une deuxième marque pour l'ajout d'eau froide - de se rapprocher de la finale correcte température de l'eau rapidement.
4. Démarrez le générateur de bruit blanc, s'il est utilisé, avant que les souris sont introduits à la salle de test. Le niveau de bruit blanc ne doit être suffisante pour masquer les bruits extérieurs. Évitez un volume élevé et s'assurer que le même niveau de bruit blanc est utilisé pour tous les animaux.
5. Apportez les animaux dans la salle de test. Si la salle de la colonie où les animaux vivent et de la salle de test sont adjacents ou très proches les uns des autres, les conditions ambiantes sont similaires et les perturbations pendant le déplacement de la cage est minime, alors aucun péri d'acclimatationod sera nécessaire. Sinon, placez les animaux dans la salle d'essai pour une période d'acclimatation (généralement au moins une heure). Si une période d'acclimatation est nécessaire, assurez-vous que les animaux acclimatés ne seront pas affectés par les souris testées en même temps dans la même pièce. S'il vous plaît être conscient que les signaux olfactifs et ultrasons peut être détecté par les autres animaux placés dans la même pièce.
6. Démarrez l'enregistrement vidéo avant de placer les animaux dans les réservoirs d'eau.
7. Tenir l'animal par la queue, et doucement et lentement dans l'eau. Une fois la souris est dans l'eau, libèrent lentement la queue. Typiquement, en utilisant cette procédure permettra d'éviter la tête de l'animal d'être submergée sous l'eau.
8. Placez la souris dans les réservoirs dans un ordre dans lequel l'obstruction de l'enregistrement seront minimisés. Cet ordre, bien sûr, doit être décidée en collaboration avec le contrepoids de groupes et d'autres exigences spécifiques à votre design expérimental.
9. Une fois que toutes les souris sont dans les réservoirs de démarrage du compte à rebours sur le chronomètre. La longueur de test habituel pour les souris est de six minutes dans la TVF.
10. Pendant l'essai, être certain que vous êtes à une distance raisonnable de l'animal et ne faites pas de mouvements ou de bruit qui peut être remarqué par les animaux. Les souris peuvent facilement flotter dans l'eau, cependant, si l'une d'une nouvelle souche de souris ou d'un nouveau composé testé, sans connaissance préalable de leurs effets sur le comportement de natation, l'expérimentateur devrait surveiller les animaux de plus près. Contrairement aux rats, les souris n'ont pas l'habitude plongée au cours de la TVF, cependant en cas de plongeon de la souris doit être retiré de la cuve. Si l'expérimentateur quitte la salle, les souris doivent être surveillés par vidéo dans le cas où une souris ne peut pas maintenir la natation et le flottant de comportement et d'arrêter le test si nécessaire.
11. A la fin de la période de six tests minute arrêter l'enregistrement. Dans notre laboratoire, nous montrons une note en face de la caméra qui identifie les animaux à la finde chaque enregistrement. Lorsque vous utilisez cette approche de l'individu par la suite marquer l'enregistrement ne sera pas connaître l'identité de l'animal puisque l'identité est seulement montré à la fin de l'enregistrement. Cela empêche toute identification et la tenue des registres des problèmes qui peuvent survenir plus tard liés aux enregistrements. Indépendamment de la stratégie de la tenue des dossiers qui est utilisé, il doit clairement identifier les animaux et aussi de prévenir l'individu plus tard, marquant le test d'avoir connaissance de travaux de groupe.
12. Retirer les animaux de l'eau par leurs queues dans le même ordre que vous les mettez à l'intérieur et en douceur les sécher avec un papier de séchage et de replacer dans leur homecage.

3. Behavior Analysis

1. La version la souris de TVF est généralement, à partir de début à la fin, six longues minutes. Cependant, en général, seules les quatre dernières minutes du test sont analysés. Cela est dû au fait que la plupart des souris sont très actifs au début de la TVF, et le peffets OTENTIEL du traitement peut être obscurcie pendant les deux premières minutes.
2. Dans notre laboratoire, nous avons télécharger les fichiers vidéo directement depuis l'appareil à un PC et faire l'analyse sur le PC.
3. Lors de l'analyse comportementale, le temps que chaque souris passe mobile est mesurée. Le montant total du temps de mobilité est alors soustrait les 240 secondes de temps de test et est ensuite indiqué que le temps d'immobilité. Bien qu'il soit possible de mesurer le temps d'immobilité directement, dans notre laboratoire, nous avons trouvé plus facile de détecter et de mesurer les mouvements actifs plutôt que de l'absence de tels mouvements.
4. L'aspect le plus important de l'analyse comportementale et généralement la plus grande source de variabilité entre les observateurs de la FST est l'identification correcte des mouvements qui sont comptés comme la mobilité de bonne foi. Notre définition opérationnelle de la mobilité dans la TVF est d'autres mouvements que ceux nécessaires à l'équilibre du corps et garder la tête hors de l'eau ⁴. Souris général flottent dans l'eau facilement, mais ils manifestent encore de petits mouvements pour équilibrer leur corps et garder la tête hors de l'eau. Ces comportements ne sont pas une tentative d'évasion et ne doivent pas être comptés comme la mobilité. Aussi, après un combat unique de mobilité, même si essentiellement immobiles, les souris peuvent encore la dérive dans l'eau à la suite de l'élan. Ces mouvements ne devrait pas être marqué comme la mobilité.
5. Dans notre laboratoire, nous utilisons une sur l'écran du chronomètre logiciel (Xnote Chronomètre, dnSoft Research Group) pour des mesures de temps. Deux chronomètres séparés sont utilisés sur l'écran. Le premier chronomètre compte à rebours de 240 secondes et d'alertes de l'observateur lors de la période d'analyse comportementale se termine. Le second chronomètre mesure le temps passé mobiles. Certains logiciels de chronomètre a la capacité d'affecter des touches pour démarrer et arrêter les fonctions, de sorte que l'écran chronomètres peuvent être contrôlés par le clavier. Dans notre laboratoire, au lieu d'un clavier ordinaire, nous utilisons un dispositif d'entrée communément appeléune "manette" pour contrôler les chronomètres.
6. Lorsque vous utilisez un PC afin de quantifier l'immobilité, s'il n'y a plus d'une souris testées et présent sur l'écran, c'est une bonne idée de couvrir les autres animaux (vous pouvez utiliser une autre fenêtre du programme ou physiquement couvrir l'écran avec le papier), de sorte que leurs mouvements ne sera pas distraire l'observateur.
7. Si un chronomètre sur l'écran est utilisée, être certain de couvrir tous les décimales mais la milliseconde du chronomètre. La raison pour cela est d'éviter un biais de l'observateur, tout en permettant toujours la capacité de déterminer si la montre est en fonctionnement ou pas. Depuis l'observateur, tandis aveugle à l'affectation aux groupes d'animaux, auront une idée générale du niveau de la mobilité chez les souris, il pourrait y avoir un biais survenant si elle est autorisée à voir le montant total du temps écoulé pour la mobilité que la souris en particulier avant la fin de la session d'analyse. En couvrant le chronomètre, elle ne sais pas si le chronomètre est activé ou désactivé à tout moment, mais Will ne sais pas le temps total écoulé et ne peut donc être effectuée par tout parti pris.
8. Un test de fiabilité inter-observateurs devraient être menées pour chaque nouvel observateur avant de commencer à collecter des données à partir d'animaux d'essai. Dans notre laboratoire, chaque nouvel observateur premières montres une notation observateur expérimenté. Après l'observateur gagne en confiance à différencier la mobilité de l'immobilité de nouvelles, ils ont ensuite score avec l'observateur expérimenté regardant et en soulignant les erreurs. Une fois cette phase est terminée avec succès, le nouvel observateur va analyser un ensemble spécifique de vidéos TSF que nous gardons dans notre laboratoire à des fins de formation. Seulement après un haut niveau de corrélation inter-observateurs est obtenu avec l'observateur expérimenté ne commence une analyse enquêteur vidéos TSF dans des expériences réelles. Nous archivons les données de ces analyses de formation pour constituer un étalon interne pour le laboratoire pour une utilisation future. Nous avons observé des différences entre les souches de la manière dans laquelle ils expriment mobilité (et immobilité) des comportements et des temps d'immobilité moyenne entre les sexes. Quand un nouveau modèle de souris souche, le sexe, ou génétiquement modifiés est testé dans le laboratoire, il est nécessaire de procéder à nouveau ce type d'analyse de fiabilité.

4. Les résultats représentatifs

Il ya des différences marquées entre les souches génétiquement distinctes de souris consanguines et non consanguines en termes de leur immobilité de base et de répondre à un médicament spécifique ^5-11. Par exemple, nous avons identifié différentielle antidépresseur réponses à de lithium dans un panel de souches de souris (figure 1) ^5. Les détails expérimentaux de cette expérience sont publiés dans Can et al., 2011 ^5.

Figure 1. Temps d'immobilité (en secondes) dans le test de la nage forcée, cinq heures après une seule injection ip de solution saline, 200, 300 ou 400 mg / kg dans consanguines différentes et outbred souches de souris. *: P <0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001 dénotent une différence significative par rapport au groupe une solution saline, le test post hoc de Dunnett. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Nombre d'animaux par groupe pour chaque souche est 6-8 (Figure reproduite à partir de ^5).

Non toutes les souches de souris sont adaptés à la FST. Certaines souches, comme le noir suisse, NIH suisse, et FVB / NJ montrent peu ou presque pas l'immobilité dans des conditions de contrôle, représentant donc un effet de sol (figure 1) ^5. Le manque d'immobilité de base empêche efficacement la détection d'un effet anti-dépresseur de manipulations expérimentales. Il est également possible, bien que très rare, que certaines souches de souris peuvent se comporter aberrante et plonger dans le réservoir pendant le test, même si elles peuvent flotter. Une souche est DBA/1OlaHsd (observation non publiée dans notre laboratoire). Ces souches ne sont pas appropriés pour la TVF. En raison de ce risque de plongée, toutefois small, lors du test d'une nouvelle souche qui n'a pas été testé précédemment dans la TSF ou une souris hébergeant une manipulation génétique novatrice, il est impératif d'observer attentivement les premiers essais pour sauver les souris si elles s'engagent dans des comportements potentiellement dangereux.

Dans la conception expérimentale décrite ici, plusieurs animaux (jusqu'à cinq) sont testés en même temps. Alors que les diviseurs nous utilisons empêcher les souris de se voir pendant le test, et le générateur de bruit blanc supprime vocalisations audibles, notre set-up ne prévient pas tous les signaux ultrasons ou olfactive d'être transmise. Bien que peu probable étant donné la nature de l'épreuve, ces pourraient affecter les comportements de souris. Une solution à ce problème serait de tester les animaux individuellement. Cependant, cette approche a ses propres problèmes. Par exemple, souvent, les animaux testés à chaque session viennent de la homecage même. Cela permet à la randomisation et de contrepoids des variables expérimentales. Tests individuels sourisment entraînerait le retrait d'une souris à un moment de la homecage. Ce sera une source de stress et les perturbations répétées de la hiérarchie sociale dans la cage parmi les autres laissés pour compte. Un autre problème avec les tests individuellement sont les contraintes de temps. Test d'une souris à un moment va étendre l'expérience dans de nombreuses heures entraînant une situation dans laquelle des souris ont été testés à différents moments du cycle circadien. Cela peut créer des temps de confusion des effets des jours. Les chercheurs devraient garder ces questions à l'esprit lors de la conception de leurs expériences.

Discussion

La TSF (parfois appelé test de natation Porsolt) a été développé d'abord pour les rats et les souris modifiées pour en Porsolt et collègues ^12,13. En plus du protocole ci-dessus décrites avec succès dans notre laboratoire, un certain nombre de modifications de test largement subtiles ont été publiés (voir Hascoët et Bourin pour un examen complet ^1). C'est un test couramment utilisé pour l'évaluation de l'efficacité des médicaments anti-dépresseurs et les effets des...

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