Fare Zorla Swim Testi

Özet

Zorla yüzmeye testi kemirgenlerde potansiyel antidepresan etkinliğini değerlendirmek için deneysel bir yaklaşım olarak onaylanmıştır. Deneysel hayvan, su ve kaçış ilgili hareketlilik davranış bir tank yerleştirilir rakamlarla gösterir. Bu testin fare sürümü için ortak prosedürler açıklanmıştır.

Özet

Zorla yüzmeye testi, antidepresan ilaçlar, antidepresan etkinliği, yeni bileşiklerin ve devletler gibi depresif kılan veya önlemeyi amaçlayan deneysel manipülasyonlar değerlendirilmesi için kullanılan bir kemirgen davranış testi. Fare kaçınılmaz şeffaf bir tank içinde su ile doldurulur ve bir kaçış ilgili hareketlilik davranışı ölçülür yerleştirilir. Zorla yüzmeye testi güvenilir bir biçimde yürütmek için basit ve minimal özel ekipman gerektirir. Zorunlu yüzme testinin başarılı bir şekilde uygulanması, haksız stres farelere belirli usul detayları ve minimizasyonu bağlılık gerektirir. Protokol tanımı ve eşlik eden video, biz bunları önlemek için, sonuçların yorumlanması ve zararlı olabilecek potansiyel tuzaklar vurgu yaparak bu testin fare sürüm yapmak için nasıl. Ayrıca, test davranışlar nasıl değerlendirilir.

Protokol

1. Gereç ve Yöntem

1.1. Su tankları

Bu malzeme, cam daha iyi tankları ve kazaların sık sık hareket dayanabilmesi olarak silindirik tanklar (30 cm yükseklik x 20 cm çapında), şeffaf pleksiglas inşa bizim laboratuvarda fare zorla yüzmeye testi (FST) için gerekli. Su seviyesi 15 cm alttan ve su hacmini fareler tutarlı olmasını sağlamak için tank üzerinde işaretlenmiş olmalıdır. Tank sayısı ideal ilk seti kullanımda iken, ikinci bir su deposu seti doldurulur, böylece bir seferde test edilen farelerin sayısı olarak en az iki kat daha fazla olmalıdır. Tankların boyutları farelerin yüzme testi sırasında, kendi ayakları ve kuyrukları ile ya tankın alt dokunmak mümkün olmayacak bir şekilde seçilmesi gerekir. Tankın yüksekliği tank kaçan fareler önlemek için yeterince yüksek olmalıdır. Lütfen dikkattank çapı ve su derinliği, farelerin davranışlarını değiştirmek için ^(1-3, bu konuların detaylı bir analiz için bakınız) ayarlanabilir önemli parametrelerdir .

1.2. Termometre

Yılından bu yana infrared termometre suya dayanıklı, hızlı sıcaklık ölçümü testi için gerekli süreyi azaltır tercih edilir. Ancak, cam bir cıvalı termometre de bu görev için yeterli olacaktır.

1.3. Timer

1.4. Video kayıt cihazı

Biz, bir tripod tarafından desteklenen bir video kamera kullanın. Bu test, genellikle aynı anda test ediliyor birden fazla hayvanlar içerdiğinden, canlı skor çok zor olabilir ve tavsiye edilmez. Video kamera, davranış puanlama için daha sonra kullanılacak olan kaliteli bir resmi işlemek için yeterince yüksek çözünürlükte kayıt altına almalıdır. Her zaman yeterli kayıt bellek startin önce kamera olduğundan emin olung test edin. Biz videoları dijital aktarım için izin veren, mekanik medya kullanımı (yani video kaset) olmadan dijital olarak kaydeden bir video kamera kullanın. Tanklar, tepegöz floresan aydınlatma ile laboratuvar ortamlarında meydana gelebilecek aşırı yansımaları varsa, fotoğraf makinesi ile bir polarize lens filtresi kullanmak isteyebilirsiniz.

1.5. Bölücüler

Bizim laboratuvarda iki takım (35 cm yükseklik x 22 cm genişlik x 22 cm derinlik) bölücüler var. Bu üç duvarları dikdörtgen ve hem de arka plan olarak ve tanklar arasında bölücüler gibi, test sırasında birbirlerini görmeye ve potansiyel davranışlarını değiştirerek fareler önlemek için kullanılır. Bir set, albino ve açık renkli hayvanlar için siyah olabilir; diğer seti, yüksek kontrast vermek amacıyla koyu renkli hayvanlar için renkli bir ışık olabilir. Deneyci kamera görüntüleri değiştirmek ya da büyük d kılmak, böylece bölücüler yüzeyleri aşırı yansıtıcı olmadığını emin olmalısınızaydınlatma düzeyleri arasındaki ifferences.

1.6. Beyaz gürültü jeneratör

Bu, ani yüksek sesler potansiyel hayvanları korkutmak olacağını duyulabilir hangi laboratuar ortamlarında ihtiyaç vardır. Gürültü jeneratör gibi aralıklı rahatsız edici sesler maskeleyebilir. Beyaz gürültü jeneratör ses seviyesi diğer ortam ve beklenmedik sesler üzerinde seçili olmalıdır. Bizim deney odasında ortam gürültü seviyesi 60 dB (aktive beyaz gürültü jeneratör olmadan). Tankların yerleştirildiği yerde aktive beyaz gürültü jeneratör ile toplam gürültü düzeyi 70-72 dB. Ancak bu rakamlar sadece örnek olarak verilmiştir olduğunu kaydetti olmalı ve her laboratuar kendi benzersiz bir ortam ve şartlara göre doğru gürültü seviyesini seçmelisiniz.

1.7. Kurutma kağıdı ve ısı lambası

, Evlerine kafeslerde hayvanlar dönmeden önce, kuruması için önemlidir.onları hafifçe kağıt havlu kullanarak ve (pozlama sıcaklığı 32 aşmadığı belli ° C), hipotermi önlemek için bir ısı lambası kullanmak yararlı olur.

2. Davranış Usulleri

1. Genel deneysel tasarım denemenize özgü değişkenler arasında uygun dengeleyebilmek yansıtmalıdır. Örneğin, deneylerde her grubun, her FST oturumu (yani, dört tedavi grubu varsa, her oturumda temsil edilecektir) eşit temsil etmek için çalışıyoruz. Ayrıca, fare döndürülebilir, her tedavi grubu, farelerin Her oturumda farklı bir tank yerleştirilir.
2. Kamera ve bölücüler pozisyonda yerleştirin. Kamera farelerin mümkün olan en yüksek çözünürlük elde etmek için mümkün olduğunca yakın olmalıdır.
3. Tanklar, tank duvarları işaretlenir belirlenen oda sıcaklığında (23-25 ​​° C) musluk suyu ile dolu olmalıdır. Tesisi sürekli sıcak / soğuk wa yoksater, doğru sıcaklık hızla su getirmek için, sıcak su ve / veya buz hazırlamak isteyebilirsiniz. Infrared termometre ile su sıcaklığını kontrol edin. Sıcak su seviyesi için tek ve soğuk su eklenmesi için ikinci bir işareti - Alternatif olarak, sıcak ve soğuk su sıcaklıkları tesiste sabit olup olmadığını, tank iki işaretleri çizebilirsiniz doğru final yakın hızla su sıcaklığı.
4. Kullanılan fareler, test odası tanıtıldı önce, beyaz gürültü jeneratörü çalıştırmak. Beyaz gürültü seviyesi sadece dış gürültüleri maskelemek için yeterli olacaktır. Yüksek ses kaçının ve beyaz gürültü ile aynı düzeyde, tüm hayvanlar için kullanılacak olan emin olun.
5. Hayvanların test odasına getirin. Hayvanların bulunduğu koloni oda ve test odasına bitişik olan veya birbirine çok yakın ise, ortam koşullarına benzer ve kafesin hareket sırasında rahatsızlık aklimasyonundan peri sonra, minimalod gerekli olacaktır. Aksi takdirde, aklimasyonundan bir süre (genellikle en az bir saat) için test odası, hayvanları yerleştirin. Aklimasyonundan süre gerekiyorsa, acclimated hayvanların aynı odada aynı anda test edilen fareler tarafından etkilenen olmayacaktır emin olun. Koku alma ve ultrasonik ipuçları aynı odada bulunan diğer hayvanlar tarafından hissedilen farkında olun.
6. Hayvanların su tankları içine yerleştirmeden önce video kaydetmeye başlayın.
7. Hayvanın kuyruğunu tutun ve su ve yavaşça yerleştirin. Fareler su sonra, kuyruk yavaş yavaş bırakın. Tipik olarak, bu yordamı kullanarak su altında kalmış olan hayvan kafası önleyecektir.
8. Kayıt engel minimize edileceği bir düzen içinde tanklarda fareler yerleştirin. Bu düzen, elbette, gruplar ve deneysel tasarım özgü diğer gereksinimleri counterbalancing ile birlikte karar verilmesi gerekir.
9. Tüm fareler kronometre tankları geri sayım başlatmak. Fareler için normal test uzunluğu altı dakika FST.
10. Test sırasında hayvanlar makul bir mesafe vardır ve hayvanlar tarafından fark edilebilir herhangi bir hareket veya gürültü yapmazlar. Fareler kolayca ya, fareler ya da yüzme davranışları üzerindeki etkilerini önceki bilginiz olmadan test edilen yeni bir bileşik yeni bir gerginlik, deneyci hayvanları daha yakından izlemek gerekir, ancak, suda yüzebilen. Sıçanlara aksine, fareler genellikle ancak dalış durumunda fare tank kaldırılması gerektiğini, FST sırasında dalış yok. Deneyi fareler davranış yüzme ve yüzen bir fare korumak ve gerekirse test durdurmak için olay video izlenmelidir odayı terk eder.
11. Altı dakikalık bir test süresi sonunda kayıt durdurun. Bizim laboratuvarda, en sonunda hayvanların tanımlayan kamera önünde bir notuHer bir kayıt. Kimliği sadece kayıt en sonunda gösterilir beri bu yaklaşımı kullanarak kayıt daha sonra puanlama hayvanların bireysel kimlik bilemezsiniz. Bu, daha sonra kayıtları ile ilgili oluşabilecek sorunları tutan herhangi bir kimlik ve kayıt engeller. Kullanılmakta olan kayıt tutma stratejisi ne olursa olsun, açıkça hayvanların tespit etmeli ve aynı zamanda daha sonra grup atamaları bilgiye sahip test puanlama bireysel önlemek.
12. Koyun ve yavaşça kendi homecage geri bir kurutma kağıdı ve yer ile kurulayın aynı sırayla onların kuyrukları tarafından hayvanların sudan çıkarın.

3. Davranış Analizi

1. FST fare sürümü, genellikle uzun, altı dakika başından sonuna kadar. Ancak, genellikle test sadece son dört dakikada bir analiz edilmektedir. Bu farelerin en FST başında çok aktif olduğu gerçeğini nedeniyle, ve ptedavinin otential etkileri, ilk iki dakika içinde gizlenmiş olabilir.
2. Laboratuarımızda, video dosyalarını doğrudan kameradan bir bilgisayara yükleyebilir ve PC üzerinde analiz yapmak.
3. Davranış analizi sırasında, her fareler cep harcadığı zaman ölçülür. Hareketliliği süresi toplam tutarı test süresi 240 saniye sonra çıkarılır ve daha sonra hareketsizlik süresi olarak belirtilmiştir. Doğrudan hareketsizlik zamanı ölçmek için mümkün olsa da, laboratuvarda daha kolay yerine bu tür hareketlerin olmaması çok aktif hareketleri algılamak ve ölçmek için bulduk.
4. FST davranış analizi ve gözlemciler arasında değişkenlik genellikle en büyük kaynak, iyi niyetli hareketlilik olarak sayılır hareketlerin en önemli özelliği doğru tanımlanmasıdır . FST hareketlilik için operasyonel tanımı dışında herhangi bir vücut dengesini ve ⁴ su üstünde kafa tutmak için gerekli hareketleri. Fare genellikle kolay, ancak onlar hala vücutlarında denge ve başlarını suyun üstünde tutmak için küçük hareketleri tezahür su içinde yüzer. Bu davranışlar, kaçmak için ve hareketlilik olarak atılır bir girişim değildir. Ayrıca, tek bir hareketlilik nöbetinden sonra, aslında hareketsiz olsa bile, fare hala momentum bir sonucu olarak su kayması yapabilirsiniz. Bu hareketler aynı zamanda hareketlilik olarak atılır.
5. Laboratuarımızda, zaman ölçümleri için ekrandaki kronometre yazılımı (XNote Kronometre, dnSoft Araştırma Grubu) kullanabilirsiniz. İki ayrı stopwatches ekranda kullanılır. Davranışsal analiz dönemi ne zaman sona erer ilk kronometre 240 saniye ve uyarılar gözlemci sayar. Ikinci kronometre zaman mobil geçirdi ölçer. Bazı kronometre yazılımı ekrandaki stopwatches klavye ile kontrol edilebilir, böylece işlevleri başlatmak ve durdurmak için tuşlar atamak yeteneğine sahiptir. Bizim laboratuvarda, normal bir klavye yerine, yaygın olarak bilinen bir giriş aygıtı kullanmakstopwatches kontrol etmek için bir 'gamepad'.
6. Test edilmiş ve ekranda birden fazla fare varsa, hareketsizlik ölçmek için bir bilgisayar kullanırken, böylece diğer hayvanlar (başka bir program penceresini kullanmak ya da fiziksel olarak kağıt ekran kapağı) karşılamak için iyi bir fikirdir onların hareketleri, gözlemcinin dikkatini dağıtmaz.
7. Eğer bir ekran kronometre kullanılan, ama kronometre milisaniye ondalık kapsayacak şekilde kesin. Bunun nedeni, gözlemci yeteneği izlemek çalıştıran veya çalışır durumda değilse belirlemek için hala izin verirken, önyargı önlemek için. Gözlemci, hayvanların grubu atamaları kör, farelerin hareketlilik düzeyi hakkında genel bir fikir olacağından, o bu özel fare için geçen hareketliliği süresi toplam miktarını görmek için izin verilip verilmediğini ortaya çıkan bazı önyargı olabilir analiz oturumun tamamlanmasından önce. Kronometre kapsayan, o sadece kronometre, herhangi bir noktada açık veya kapalı olduğunu ancak wil olmadığını bilecekl toplam süre geçen ve bu nedenle herhangi bir önyargı etkilenmez olamaz bilmiyorum.
8. Bir gözlemciler arası güvenilirlik testi, test hayvanlardan elde edilen verileri toplamak için başlamadan önce her yeni gözlemci için yapılmalıdır. Laboratuvarımızda, her yeni gözlemci ilk deneyimli bir gözlemci puanlama izler. Hareketsizlik hareketliliği ayırt etmek için yeni bir gözlemci kazanımlar güven sonra, daha sonra deneyimli bir gözlemci izliyor ve herhangi bir hata işaret skoru. Bu aşamada başarılı bir şekilde tamamlandıktan sonra, yeni gözlemci, eğitim amaçlı laboratuvarımızda devam FST videolar belirli bir analiz edecektir. Gözlemciler arası korelasyon yüksek düzeyde deneyimli gözlemci ile elde edilir sonra gerçek deneyler FST videos analiz eden bir araştırmacı başlangıç. Biz bu eğitim analizleri verileri gelecekte kullanmak için laboratuvara için bir iç standart teşkil arşiv. Biz onlar mobi ifade edildiği biçimde suşları arasındaki farklılıklar gözlemlediklity (ve hareket) davranışları, ve cinsiyetler arasındaki ortalama hareketsizlik süresi. Zorlanma, cinsiyet, ya da genetik olarak değiştirilmiş yeni bir fare modeli laboratuvarda test edildiğinde tekrar bu tür güvenirlik analizi gerçekleştirilmesi için gerekli.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Bazal hareketsizlik ve belirli bir ilaca ^5-11 yanıt açısından, genetik olarak farklı kendilenmiş ve outbred fare suşları arasında belirgin farklılıklar vardır . Örneğin, bir fare suşlarının paneli (Şekil 1) ⁵ lityum diferansiyel antidepresan gibi tepkileri belirledi. Bu deneyde deneysel ayrıntıları Can ve ark, 2011 ⁵ yayınlanmaktadır.

Şekil 1. zorunlu yüzme testinde Hareketsizlik süresi (saniye) çeşitli kendilenmiş ve ou, tuzlu su, 200, 300, veya 400 mg / kg tek bir IP enjeksiyon, beş saat sonratbred fare suşlarının. *: P <0.05, **: p <0.01, ***: p <0.001 tuzlu grup, Dunnett Kullanıcı post hoc testi ile karşılaştırıldığında önemli bir fark göstermektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilir. Her bir suş için grup başına düşen hayvan sayısı, ^6-8 (5 çoğaltılamaz Şekil ).

Tüm fare suşlarının FST için uygundur. Bu nedenle, İsviçre, NIH İsviçre, ve FVB / NJ gibi bazı suşları, bir zemin etkisi (Şekil ¹⁾ 5 temsil kontrol koşulları altında, çok az veya hemen hemen hiç hareketsizlik göstermektedir. Bazal hareketsizlik eksikliği etkili bir anti-depresan etkisi deneysel manipülasyon tespit önler. Dalgalanmaya rağmen bazı fare suşları aberrantly davranmaya ve test sırasında tankın içine dalış olabilir, çok nadir ise de mümkündür. Böyle bir suş (laboratuvarımızda yayınlanmamış gözlem) DBA/1OlaHsd. Bu suşlar FST için uygun değildir. Bu nedenle dalış risk, ancak small FST ya da bir roman genetik manipülasyon barındıran bir fare daha önce test edilmemiş yeni bir gerginlik test ederken, çok dikkatli bir şekilde, potansiyel olarak zararlı davranışları meşgul fareler kurtarmak için ilk çalışmaları gözlemlemek için zorunludur.

Deneysel tasarım birden fazla hayvan (beş) aynı anda test edilir, burada açıklanan. Kullanan bölücüler farelerde test esnasında birbirlerini görmesini engellemek ve beyaz gürültü jeneratörü sesli seslenmelere bastırır iken, set-up iletilen tüm ultrasonik veya koku alma ipuçları önlemek değildir. Olası test doğaya verilen rağmen, bu farelerin davranışlarını etkileyebilir. Bu sorunun bir çözümü hayvanların ayrı ayrı test etmek olacaktır. Ancak, bu yaklaşım, kendi sorunları var. Örneğin, yaygın olarak, her oturumun test hayvanlar aynı homecage geliyor. Bu deneysel değişkenlerin randomizasyon ve dengelemek sağlar. Test fareler bireyselly bir fare homecage bir zamanda kaldırma anlamına gelecektir. Bu geride kalan diğerleri arasında kafes tekrarlanan stres ve sosyal hiyerarşinin rahatsız neden olacaktır. Test ile diğer bir konu tek başına, zaman kısıtlamaları vardır. Bir seferde tek bir fare Test deney fareler sirkadiyen döngüsünün farklı zamanlarda test edildiği bir durum sonucunda birçok saat uzatacaktır. Bu gün etkileri karıştırıcı zaman yaratabilir. Deney tasarlama, araştırmacılar, bu konuları göz önünde tutmalıdır.

Tartışmalar

FST (bazen Porsolt yüzmeye testi denilen), sıçanlar için ilk geliştirilen ve fareler için Porsolt ve ^{meslektaşları} 12,13 tarafından güncellenmiştir . Laboratuvarımızda başarılı yukarıda açıklanan protokole ek olarak, büyük ölçüde ince test değişiklikler bir dizi (tam bir incelemesi ¹ için bkz. Hascoët ve BouriN) yayınlanmıştır . Anti-depresan ilaçlar ve etkileri temel ve preklinik araştırma ^3,14-16 çeşitli davranışsal ve nörobiyolojik manipülasyon...

Malzemeler