La evaluación de alteraciones hepáticas metabólicas durante la colonización progresiva de la libre de gérmenes de ratón por 1 H espectroscopía de RMN

Resumen

El procedimiento se describe la colonización progresiva de seguir evaluando su impacto sobre el metabolismo hepático de acogida. La colonización se controla de manera no invasiva mediante la evaluación de la excreción urinaria de los metabolitos microbianos co-mediante RMN basados ​​en los perfiles metabólicos, mientras que el metabolismo hepático es evaluado por alto ángulo Resolución Magic Spinning (MAS HR) de perfiles de RMN de la biopsia intactas.

Resumen

Es bien sabido que las bacterias intestinales contribuyen significativamente a la homeostasis de acogida, proporcionando una serie de beneficios tales como la protección inmunológica y la síntesis de la vitamina. También proveen el host con una considerable cantidad de nutrientes, por lo que este ecosistema un órgano metabólico esencial. En el contexto de la creciente evidencia de la relación entre la flora intestinal y el síndrome metabólico, la comprensión de la interacción metabólica entre el huésped y su microbiota intestinal se está convirtiendo en un reto importante de la biología moderna. ^1-4

Colonización (también conocido como proceso de normalización) designa a la creación de micro-organismos en un antiguo libre de gérmenes de origen animal. Si bien es un proceso natural que ocurre al nacer, que también se utiliza en adultos libres de gérmenes animales de controlar el ecosistema floral intestinal y más determinar su impacto sobre el metabolismo de acogida. Un procedimiento común para controlar el proceso de colonización es utilizar el método de alimentación forzada con una single o una mezcla de microorganismos. Este método da como resultado una colonización muy rápida y presenta la desventaja de ser muy estresante ^5. Por tanto, es útil para minimizar el estrés y para obtener un proceso de colonización más lenta para observar poco a poco el impacto de la creación de bacterias en el metabolismo de acogida.

En este artículo, se describe un procedimiento para evaluar la modificación del metabolismo hepático durante el proceso de colonización gradual mediante una técnica no destructiva del metabolismo de perfiles. Proponemos para controlar la colonización microbiana intestinal mediante la evaluación de la actividad metabólica microbiana intestinal refleja en la excreción urinaria de los metabolitos microbianos co-por ^un perfil de RMN basado metabólico. Esto permite una apreciación de la estabilidad de la actividad microbiana intestinal más allá del establecimiento estable del ecosistema microbiano intestinal suele evaluarse mediante el control de bacterias fecales por DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante). ⁶ Elcolonización se lleva a cabo en un ambiente abierto convencional y se inicia con una arena sucia contaminada con animales convencionales, que servirá como control. Los roedores son animales coprófagos, lo que garantiza una colonización homogénea a lo descrito previamente ^7.

Perfiles metabólicos hepáticos se mide directamente a partir de una biopsia de hígado intacto con ^una H de alta resolución Magic Angle Spinning espectroscopía de RMN. Esta técnica semi-cuantitativa ofrece una forma rápida de evaluar, sin dañar la estructura celular, los principales metabolitos, como los triglicéridos, la glucosa y el glucógeno con el fin de estimar más la compleja interacción entre el proceso de colonización y el metabolismo hepático ^70-10. Este método también se puede aplicar a cualquier tejido de la biopsia ^11,12.

Protocolo

1. La colonización de animales libres de gérmenes y la recogida de muestras

1. Eliminar animales libres de gérmenes de aisladores y de la casa en una sala de cría en jaulas convencionales equipados con filtro delante de los animales convencionales que servirán como controles (Figura 1).
2. Mezclar medio de la camada (3 días) tomado de la caja de control convencional con la materia fecal de los animales libres de gérmenes. Siempre mantenga un tercio de la basura convencional sucia cada vez que hay que renovar con el fin de mantener un nivel de bacterias (mantener al menos durante 3 días).
3. Recoger la orina en un microtubo de 1,5 ml por el manejo del ratón sobre el tubo y ayudar a la micción por un suave masaje en el intestino. Complemento congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. Almacene al menos a -40 ° C hasta su análisis de RMN. Un volumen mínimo de 20 l se requiere para la adquisición de 5 mm de la sonda de RMN, pero se recomienda el uso de 30 l para mejorar la calidad de los perfiles metabólicos.
4. Los animales deben be la eutanasia sin el uso de algún tipo de anestesia a fin de evitar resonancias de RMN de confusión debido a un metabolismo hepático de los compuestos anestésicos (por ejemplo, el uso dislocación cervical seguido por la confirmación de la muerte por desangramiento)

2. Recomendación para la recolección de la biopsia hepática

1. No use ningún producto que contenga alcohol para evitar la contaminación. Lave las herramientas con solución de agua o solución salina.
2. No perfore la vesícula biliar. En caso de fuga de bilis, lavar los tejidos inmediatamente con agua o solución salina.
3. Recoger las biopsias de hígado (alrededor de 15-50 mg) en el lóbulo izquierdo, como se muestra en la Figura 2. Para las biopsias reproducible, recoger constantemente en el centro del lóbulo izquierdo evitando las zonas periféricas donde el tejido es más delgada.
4. Ajustar las biopsias de congelación en nitrógeno líquido inmediatamente y almacenarlos a -80 ° C hasta el análisis de RMN.

3. ^{1H NMR} adquisición de orina microvolumen

1. Prepare el fosfato de sodio 0,2 M tampón en D2O (99,8%), pH 7,4, que contenía 1 mM 3 - (trimetilsilil) de ácido propiónico-d ₄ (TSP).
2. Mezclar 30 l de orina con 30 l de tampón fosfato de sodio.
3. Transferencia de 50 l de solución mixta en 1,7 mm tubo de RMN capilar (Figura 3 (2)) con una jeringa de vidrio de 50 l equipado con una aguja de metal (OD 0.5 mm). Tenga cuidado para evitar las burbujas.
4. Ajuste el adaptador capilar (Figura 3) (3) en la parte superior de la muestra de orina que contiene capilares y colocarlo en un microtubo de RMN de 2,5 mm por 5 mm de RMN de la sonda (Figura 3) (1). El uso de esta combinación de tubos como un tubo de RMN regular de 5 mm para la adquisición del espectro.
5. Utilice la barra de extracción (Figura 3) (4) para eliminar capilar de 2,5 mm tubo de RMN, atornillando el adaptador capilar con cuidado para sacarlo.

. 4 ¹ H HR RMN MAS de tejido biopsia del hígado: la preparación de muestras

1. MAS componentes del rotor y las herramientasdescritos en la Figura 4.
2. Inserte una biopsia (alrededor de 15-50 mg) en el rotor de circonio (Figura 4) (1) y llenar el resto del volumen con puro O D ₂ de RMN de bloqueo. Tenga cuidado de no hacer que las burbujas, porque esto altera la calidad de las cuñas posteriores y la calidad de la adquisición de datos.
3. Introduzca 50 L espaciador de teflón (Figura 4) (2) utilizando el tornillo cilíndrico (Figura 4) (5). Desenroscar y calibrar usando el medidor de profundidad en el lado corto (Figura 4 (8)). En este paso, es importante prestar una atención específica a la muestra porque parte de ella puede filtrarse a través del orificio del espaciador. Si este es el caso, entonces parte de la biopsia se destruye y el peso de la muestra ya no es confiable. Lo que es necesario volver a empezar desde el principio la preparación de la muestra.
4. Coloque el pasador THEAD (Figura 4) (3) y el tornillo suavemente con el destornillador (Figura 4 (6)). Secar el agua residual con un pedazo de tejido.
5. Colocar la tapa (figura 4) (4) en elparte superior del rotor y la inserta en el empacador rotor (Figura 4 (6)). Presione firmemente hasta que la tapa está en su lugar. No debe haber ningún espacio entre el rotor y la tapa.
6. Marca la mitad de la parte inferior del rotor con un rotulador negro para permitir la detección óptica de la velocidad de rotación.
7. Coloque el rotor en el interior del espectrómetro de RMN y comenzar a girar a 5 kHz. Adquirir ^un espectro de RMN de H con CPMG secuencia de pulsos ¹³ de acuerdo con las directrices del fabricante.
8. El uso de resonancia α glucosa anomérico a 5,22 ppm (doblete) para calibrar los espectros de RMN.
9. Para descomprimir el rotor, proceder mediante la eliminación de la tapa con el removedor de la tapa (Figura 4 (9)). Desenroscar y quitar elementos thead pin espaciador de teflón con el tornillo cilíndrico. Lavar exhaustivamente con agua y detergente.

5. Resultados representante

La actividad microbiana del intestino pueden ser monitoreados utilizando un perfil metabólico urinario. Un gran número de microorganismos urinariosco-metabolitos identificados por ^RMN-1H han sido descritos en la literatura ^7,14-17. Estos co-metabolitos microbianos son particularmente útiles para vigilar el proceso de colonización, ya que proporcionan una manera rápida y no invasiva para estimar que el ecosistema de reciente creación es estable. Figura 5A ilustra claramente la aparición de microbios intestinales co-metabolitos sobre el proceso de colonización. Esta cifra muestra un perfil metabólico urinario obtenerse por el procedimiento descrito en el paso 2 para un animal colonizó 20 días usando el procedimiento descrito en el Paso 1. Este animal no excretar sulfato indoxyl y cantidades muy pequeñas de phenylacetylglycine (PAG) y p-cresol sulfato en el estado libre de gérmenes (día 0-azul). Como la colonización avanza, estos tres marcadores del metabolismo de proteínas por la flora intestinal aumentan considerablemente para llegar a un equilibrio en el día 20 (rojo). Esto es particularmente fácil de controlar para un grupo de animales, como se ilustra en la Figura 5B con el PAGresonancia. Este diagrama se obtiene integrando el área bajo la resonancia con fondo gris en la Figura 5 (δ 7.40-7.43), que corresponde a una resonancia específica (triplete) de PAG de un grupo de 7 animales.

¹ H de alta resolución angular Magic Spinning (MAS HR) espectroscopía de RMN es una técnica no destructiva que permite la adquisición rápida y reproducible de los perfiles metabólicos de cualquier tipo de biopsia ^18. En este protocolo, se utilizó esta técnica de gran alcance para obtener un perfil metabólico hepático de los ratones antes de 2 (azul) y después (rojo) la colonización (Figura 6). Esta figura ilustra bien la información que se puede derivar de un MAS RMN basados ​​en el perfil metabólico. Numerosos aminoácidos, así como los metabolitos derivados del metabolismo energético, como la glucosa, glucógeno, lactato, triglicéridos, (D)-3-hidroxibutirato y nicotinurate puede ser visualizada. Estos perfiles contienen información relevante para el estrés oxidativo (es decir, un ascórbicocid, el glutatión), el metabolismo de nucleótidos (es decir, inosina, uridina) y el metabolismo de metilamina (es decir, la colina, trimetilamina N-óxido). En este ejemplo, es muy claro que la libre de gérmenes del ratón muestra casi ningún glucógeno y cantidades muy bajas de glucosa y triglicéridos, se publicó anteriormente ^7.

Figura 1. Descripción general del protocolo de la colonización. Animales libres de gérmenes y convencionales están alojados en jaulas equipadas con filtros de lado a lado y sus camadas se intercambian para permitir la colonización progresiva de la flora intestinal convencional (1). La actividad microbiana del intestino se controla mediante ^un perfil de RMN basado metabólico (2-3). El metabolismo hepático es evaluado por ¹ H RMN MAS de recursos humanos basada en el perfil metabólico (4-5).

Figura 2. Ratón vivor anatomía. El hígado se muestra como la parte plana del órgano frente a la mesa. Para las biopsias reproducible, se recomienda recoger muestras siempre desde el centro del lóbulo izquierdo según lo indicado por el rectángulo de trazos.

Figura 3 1,7 mm kit RMN capilar para trabajar con microvolúmenes clave:.. 1: 2,5 mm microtubo RMN, 2: 1,7 mm tubo de RMN capilar, 3: adaptador capilar, 4: Extracción de la varilla.

. MAS Figura 4 rotor equipos clave: 1.: Rotor MAS, 2: 50 l espaciador de teflón, 3: Thead pines, 4: gorra, 5: tornillos cilíndricos, 6: destornillador, 7: rotor envasador, 8: medidor de profundidad.

Figura 5. Evolución de los perfiles metabólico urinario durante colonization.

1. Zoom en la región aromática del espectro de entre 6.8 a 7.8 ppm, donde co-metabolitos microbianos pueden ser visualizados. ¹ H RMN se deriva de una sola persona en el día 0 (azul), 4 (verde), 15 (naranja) y 20 (rojo) post-colonización. La zona gris corresponde a la zona que se ha integrado para hacer el diagrama de la B. Principales: 1-MeHistamine: 1-metilhistamina; indoxil-S: El sulfato de indoxyl;:; Su p-cresol-S Histidina: sulfato de p-cresol, PAG : Phenylacetylglycine.
2. Concentración de PAG promedio durante la colonización (n = 7). La t de Student se utilizó la prueba para comparar la diferencia en la concentración de PAG en diferentes puntos de tiempo: a: p

Figura 6. Típicos 600 MHz ¹ H HR espectros de RMN MAS de las biopsias hepáticas derivadas de libres de gérmenes (azul) y ex-libre de gérmenes (red) los ratones. Protones en negrita son los responsables de la resonancia de triglicéridos clave:. 3-HB: 3-hidroxibutirato, GSH: glutatión reducido, TG: triglicéridos, OTMA: trimetilamina-N-óxido.

Discusión

En este protocolo, que describe un procedimiento de colonización progresiva en un entorno abierto para seguir investigando el impacto de la microbiota intestinal en el metabolismo hepático evaluado por ¹ H RMN de perfiles de recursos humanos del MAS intacta biopsia. Varios métodos de colonización han sido descritos en la literatura. Los métodos más comunes para colonizar los animales con una microbiota definida son una sonda nasogástrica o beber agua contaminada ^19,20. Inoculación fecal tam...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,5 mm microtubo	Nueva Era	NE-H5/2.5-V-Br
1,7 mm tubo capilar	Sigma-Aldrich	NORS175001
Adaptador capilar	Nueva Era	NE-325-5/1.7
La extracción de la barra	Nueva Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 con 50 l esférica de teflón kit de espaciadores	Bruker	HZ07213
Kit de herramientas para 50 inserciones l	Bruker	B2950
Avance III 600MHz RMN	Bruker
1 H HR MAS RMN sólidos sonda	Bruker
Óxido de deuterio 99,9%	Sigma-Aldrich	530867-1L
3 - (trimetilsilil) propiónico ácido-d 4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913