Las formulaciones para la liofilización de las bacterias y su influencia en la supervivencia celular

Resumen

La liofilización es a menudo una manera fácil y conveniente de obtener productos secos de células bacterianas viables. Un problema del proceso es la supervivencia celular. Nos detalle aquí un procedimiento para investigar cómo la supervivencia celular durante la liofilización está influenciada por las propiedades de la formulación utilizada.

Resumen

Agua celular se puede quitar para inactivar microorganismos reversible para facilitar el almacenamiento. Uno de tales métodos de eliminación es la liofilización, que se considera un método de deshidratación suave. Para facilitar la supervivencia celular durante el secado, las células se formulan a menudo de antemano. La formulación forma una matriz que incorpora las células y los protege de diversas tensiones perjudiciales impuestas a las células durante la congelación y el secado. Se presenta aquí un método general para evaluar la tasa de supervivencia de las células después de la liofilización y que se ilustra mediante la comparación de los resultados obtenidos con cuatro formulaciones diferentes: la sacarosa, el disacárido sacarosa polímero derivado de Ficoll PM400, y los respectivos polisacáridos hidroxietil celulosa (HEC ) e hidroxipropil metil celulosa (HPMC), en dos cepas de bacterias, P. putida KT2440 y A. A6 chlorophenolicus. En este trabajo se ilustra cómo preparar formulaciones para la liofilización y cómo investigar la mecánicaismos de la supervivencia celular después de la rehidratación mediante la caracterización de la formulación utilizando de calorimetría diferencial de barrido (DSC), mediciones de tensión superficial, análisis de rayos X, y la microscopía electrónica y en relación a los datos de las tasas de supervivencia. Los polímeros se eligen para obtener una estructura monomérica del respectivo polisacárido sacarosa se asemeja a un mayor o menor grado. El uso de este método de instalación que mostramos que los polímeros pueden apoyar la supervivencia de las células tan eficazmente como disacáridos si ciertas propiedades físicas de la formulación son controlados ^1.

Protocolo

1. El cultivo y la cosecha de P. putida

1. Preparar un cultivo iniciador de Pseudomonas putida mediante la inoculación de 100 ml de caldo de soja tríptico (TSB) con una colonia de P. células putida cultivadas en agar suplementado con caldo de soja tríptico (TSA). Mantener el cultivo a 30 ° C en un tablero de agitación fijado en 130 rpm.
2. Después de 7 h transferir una alícuota del cultivo iniciador equivalente a 1/10 del volumen final del cultivo principal a la TSB-medio fresco. Mantener las células a 30 ° C en un tablero de agitación a 130 rpm durante 16 horas.
3. Después de 16 h de crecimiento de las células se recogen por centrifugación del cultivo celular a 1500 xg durante 20 min a TA. Decantar el sobrenadante y lavar las células mediante re-suspensión del sedimento celular se encuentra en una solución de NaCl que es isotónica con el medio de crecimiento. En este caso se utilizó una solución de NaCl 150 mM. Las células se centrifugan una vez más y se decanta el sobrenadante antes de resuspender las células en el medio de formulación,véase el paso 3.2.

2. El cultivo de otras especies

1. Para adaptar el protocolo a otras especies bacterianas los procedimientos de cultivo y la cosecha deben ser cambiados de acuerdo a los requerimientos de esa especie. Para evitar el choque osmótico al manipular las células durante la cosecha y la etapa de lavado (s), la osmolalidad de las soluciones debe coincidir con la del medio de crecimiento en la cosecha.

3. Formulación de las células

1. Preparar las soluciones de formulación pesando los componentes de la matriz respectivas y disolverlos en agua. Para lograr condiciones isotónicas, o bien ajustar la cantidad de excipiente o añadir NaCl o algún otro soluto compatible celular para llegar a la osmolalidad deseada. Para las sustancias de bajo peso molecular, tales como disacáridos las cantidades se pueden ajustar fácilmente para llegar a condiciones isotónicas. En sustancias como polímeros que son de alto peso molecular, la tonicidad tiene que ser ajustado con células compatibles por lolaúdes, por ejemplo, NaCl o disacáridos. Tenga en cuenta que cualquier adición de una sustancia influirá en las propiedades físicas de la formulación, que a su vez puede influir en el comportamiento de la liofilización y la supervivencia celular.
2. Decantar la solución de lavado (en este caso NaCl) y volver a suspender las células en los respectivos medios de formulación.
3. Asegúrese de que las células se dispersan homogéneamente. Las formulaciones de baja viscosidad se agitaron mientras que las formulaciones de viscosidad más altos se mezclan usando añadiendo, por ejemplo., Una barra de agitación y agitar el recipiente hasta que se logra una mezcla homogénea.
4. Divida las formulaciones en viales de congelación de pelo. Los viales se deben pesar vacío, con la muestra antes y después de secado por congelación para calcular la cantidad de agua eliminada durante la liofilización.
5. Añadir tapones de goma de los viales si los viales deben ser sellados en el interior del liofilizador, consulte el paso 4.3.
6. Enumerar las células en cada formulación antes de la liofilización, consulte el paso 6.

4. La liofilización

1. Las condiciones de secado por congelación se tienen que ajustar a las propiedades físicas de la formulación. El parámetro más importante es en este caso la temperatura de transición vítrea, Tg, de la formulación, denota Tg 'para la muestra de congelación y concentrada para indicar que el agua está todavía presente. La Tg 'de la formulación de congelación-concentrada se mide fácilmente utilizando calorimetría de barrido diferencial (DSC), véase el paso 7.
2. Ajustar los parámetros del proceso de liofilización de manera que la temperatura de la muestra es siempre por debajo de la Tg de la muestra y que la presión de la cámara permite una rápida sublimación del hielo, es decir, el secado primario, y el agua residual en la formulación, es decir, secundaria secado. Si la temperatura de la muestra está por encima de Tg 'durante el proceso de secado hay un gran riesgo de colapso estructural de la muestra lo que puede disminuir significativamente la supervivencia celular.
3. Para proteger los productos secos después de freeze-secado de la atmósfera de la muestra tiene que ser controlado. Si es posible, sellar las muestras en el secador por congelación antes de que el vacío se libera al final del ciclo de secado por congelación. Alternativamente, los frascos se pueden llenar con una atmósfera preferida. Es importante evitar la exposición de las muestras a las condiciones ambientales como la humedad o el oxígeno presente en la atmósfera de almacenamiento se influye en la supervivencia de las células.
4. Pesar los viales.

5. Rehidratación

1. Rehidratar las muestras con agua desionizada y estéril. La cantidad de agua que debe añadirse debe ser la misma que la cantidad eliminado durante la liofilización y se calcula a partir del peso del vial vacío, el mismo vial con la muestra antes y después de la liofilización. Vortex las muestras una y otra vez hasta que las soluciones a continuación, aparece homogénea.

6. Enumeración

1. Dibuje 100 l de cada muestra y hacer diluciones en serie de 10 veces. A partir de las diluciones de integración100 l resto se siembra en placas de TSA. Las placas se incubaron a la temperatura y el tiempo requerido.

7. Caracterización de la formulación de comportamiento de la congelación

1. Tomar una pequeña cantidad, 5 a 10 mg, de la muestra y encerrarlo en una sartén DSC-aluminio con tapa. Prepare un recipiente vacío como referencia.
2. Establecer el programa de análisis de temperatura DSC. El programa de enfriamiento está configurado para imitar la etapa de congelación en el programa de secado por congelación. Esto se hace como la cinética de enfriamiento pueden influir en la Tg 'de las formulaciones hidratadas. Antes de la exploración de calefacción comienza a reducir la temperatura por debajo de la Tg esperado "de las formulaciones investigadas, normalmente -100 ° C.
3. Elija un tipo adecuado de calentamiento, normalmente una velocidad de calentamiento de 5 - 40 º C / min se utiliza. La señal de flujo de calor registrada se expresa en vatios y se verá influido por la velocidad de calentamiento. A mayor velocidad de calentamiento dará una señal más grande de Tg.
4. Ajuste el rango de temperatura de manera que it cubre tanto Tg 'y el derretimiento de la formulación.

8. Las mediciones de tensión superficial de las formulaciones hidratadas

1. El montaje experimental usado en este experimento es de acuerdo con el método du Noüy para medir la superficie.
2. Limpie el anillo de platino y el recipiente de medición con cuidado. El recipiente se enjuagó con acetona, se secó con un paño libre de pelusa, y luego quemada en el interior con una llama incolora. El anillo se ilumina en rojo en una llama incolora.
3. Llene el recipiente con la solución y deje que la superficie resolver antes de medir. Para las soluciones que se alcanza el estado de equilibrio sólo después de un largo tiempo, por ejemplo, polímeros, la sencilla configuración utilizada aquí proporcionarán datos cualitativos.
4. Para las formulaciones con altas viscosidades, por ejemplo soluciones de 2% (w / w) de HEC o de HPMC, la tensión superficial tiene que ser medido en soluciones de concentraciones más bajas y luego extrapolada. Esto se puede hacer tomando ventaja del hecho de quela caída en los niveles de tensión superficial frente a concentraciones por debajo de 0,5% (w / w).

9. Análisis de rayos X de las formulaciones secas

1. Tomar una pequeña cantidad de matriz / bacterias y cargarlo en un soporte de muestras.
2. Monte el soporte de la muestra en el X-ray-difractómetro.
3. Para analizar cualquier fase cristalina presente en la muestra el paquete de programas de Bruker EVA se puede utilizar.

10. Microscopía Electrónica

1. Tomar una pequeña cantidad de matriz / bacterias de los viales y fijarlo en un talón SEM.
2. Cargar el titular de SEM en el dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica (Thermo Polaron VGScientific SC7640 utilizado en el presente trabajo) y la capa de la muestra con unos pocos nm de Au / Pd o Pt. En estos experimentos, los parámetros de pulverización fueron: 1900 V, 20 mA y 20 segundos, para un ~ 5-10 nm recubrimiento Au / Pd. El recubrimiento reduce la carga eléctrica durante la adquisición de imagen. Se recomienda comenzar con una capa fina y, si persiste la carga y hace que la imagenartefactos, la muestra deben estar recubiertos de nuevo.
3. Cargar el titular de SEM en la cámara de SEM. Seleccione los parámetros de imagen correspondientes. Para el instrumento utilizado en la Figura 2 (FEI Strata DB235), se utilizó 5 kV de voltaje de aceleración, tamaño de spot 3, una distancia de trabajo de 5 mm y el detector de electrones secundarios.
4. Opcionalmente, es posible utilizar el haz de iones enfocado para cortar secciones transversales de las bacterias incrustadas en el polímero para revelar más detalles.

Resultados

La Tabla 1 muestra los datos sobre la composición de la formulación, eventos térmicos registrados por DSC durante el calentamiento de las formulaciones congeladas, la estructura de las muestras secas y la tensión superficial de las soluciones de formulación. La _Tg 'de sacarosa se ​​ha determinado a -40 ° C ^{2, 3} y puede ser difícil de detectar para concentraciones de sacarosa inferior al 20% w / w. El evento térmico a -35 ° C está probablemente relacionado...

Discusión

El motivo de este estudio fue investigar algunas propiedades de formulación que puedan ser de importancia para la supervivencia celular durante la liofilización. Aunque la tolerancia intrínseca secado varía entre las diferentes especies, como se ilustra en la Figura 1A, la tendencia de qué tan bien la diferente supervivencia de las células de soporte formulaciones es similar. Es informativo para comenzar con una comparación de la sacarosa y Ficoll. Se cree que un factor clave para una formulació...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.