As formulações para liofilização de bactérias e sua influência na sobrevivência das células

Resumo

Liofilização é muitas vezes uma forma fácil e conveniente de obter produtos secos de células bacterianas viáveis. Uma questão do processo é a sobrevivência da célula. Nós detalhe aqui um processo para investigar a forma como a sobrevivência das células durante a liofilização é influenciada pelas propriedades da formulação utilizada.

Resumo

Cellular água pode ser removida para inactivar reversivelmente microorganismos para facilitar o armazenamento. Um tal método de remoção é a liofilização, que é considerado um método de desidratação suave. Para facilitar a sobrevivência das células durante a secagem, as células são frequentemente formuladas anteriormente. A formulação forma uma matriz que incorpora as células e protege-los a partir de várias tensões impostas nocivos sobre as células durante a congelação e secagem. Apresenta-se aqui um método geral para avaliar a taxa de sobrevivência das células após a liofilização e demonstramos pela comparação dos resultados obtidos com quatro formulações diferentes: a sacarose, o dissacárido sacarose derivada polímero Ficoll PM400, e os respectivos polissacáridos hidroxietil celulose (HEC ) e hidroxipropil-metil-celulose (HPMC), em duas estirpes de bactérias, P. putida KT2440 e A. A6 chlorophenolicus. Neste trabalho, ilustram como preparar formulações para liofilização e como para investigar o mecaismos de sobrevivência celular após a reidratação, caracterizando a formulação utilizando de calorimetria exploratória diferencial (DSC), medições de tensão superficial, análise de raios-X e microscopia eletrônica e relacionar esses dados com as taxas de sobrevivência. Os polímeros foram escolhidas para obter uma estrutura monomérica do respectivo polissacarídeo sacarose assemelhando-se a um em graus variados. Usando este método de instalação que mostrou que os polímeros podem suportar a sobrevivência celular tão eficazmente como dissacarídeos se certas propriedades físicas da formulação é controlada ^1.

Protocolo

1. Cultivo e colheita de P. putida

1. Prepara-se uma cultura iniciadora de Pseudomonas putida, por inoculação de 100 mL de caldo de soja tríptica (TSB) com uma colónia de P. putida células cultivadas em agar suplementado com caldo de soja tríptico (TSA). Manter a cultura a 30 ° C em uma placa de agitação fixada em 130 rpm.
2. Após 7 hr transferir uma parte alíquota da cultura iniciadora equivalente a 1/10 do volume final da cultura principal para TSB-meio fresco. Manter as células a 30 ° C em uma placa de agitação a 130 rpm durante 16 horas.
3. Após 16 horas de crescimento, as células são colhidas por fiação a cultura de células a 1.500 xg durante 20 min à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e lava-se as células re-suspendendo a pelete celular é uma solução de NaCl que é isotónica com o meio de crescimento. Neste caso, foi utilizada uma solução de NaCl 150 mM. As células são, então, centrifugadas mais uma vez e o sobrenadante é decantado antes de ressuspensão das células em meio de formulação,veja o passo 3.2.

2. Cultivo de outras espécies

1. Para adaptar o protocolo para outras espécies bacterianas os procedimentos de cultivo e colheita deve ser alterado de acordo com as exigências da espécie. Para evitar choque osmótico das células durante o manuseamento durante a colheita e a etapa de lavagem (s), a osmolalidade das soluções deve corresponder ao do meio de crescimento no momento da colheita.

3. Formulação de células

1. Preparar as soluções de formulação por pesagem para os respectivos componentes da matriz e que se dissolvem em água. Para atingir as condições isotónicas, ou ajustar a quantidade de excipiente ou adicionar NaCl ou algum outro soluto compatível célula alcançar a osmolaridade desejada. Para as substâncias com baixo peso molecular, tais como as quantidades dissacarídeos pode ser facilmente ajustado para alcançar condições isotónicas. Para substâncias como polímeros que são de elevado peso molecular, a tonicidade deve ser ajustada de modo compatível com a célulaalaúdes, por exemplo, NaCl ou dissacarídeos. Note-se que a adição de qualquer substância irá influenciar as propriedades físicas da formulação, o que, por sua vez, podem influenciar o comportamento de secagem por congelação e sobrevivência celular.
2. Decantar a solução de lavagem (neste caso de NaCl) e re-suspender as células nos respectivos meios de formulação.
3. Certifique-se de que as células são homogeneamente dispersa. Formulações de baixa viscosidade são agitadas enquanto formulações de viscosidades mais elevadas são misturados usando pela adição, por ex., Uma barra de agitação e agitando o recipiente até que a mistura homogénea é atingida.
4. Separe as formulações em frascos liofilizador. Os frascos devem ser pesadas vazias, com a amostra antes e após a criodessecagem para calcular a quantidade de água removida durante a liofilização.
5. Adicionar rolhas de borracha para os frascos se os frascos devem ser selado dentro do liofilizador, consulte o passo 4.3.
6. Enumere as células em cada formulação antes da liofilização, consulte a etapa 6.

4. Liofilização

1. As condições de secagem por congelação têm de ser ajustados para as propriedades físicas da formulação. O parâmetro mais importante é, neste caso, a temperatura de transição vítrea, Tg, da formulação, denotada Tg 'para a amostra crioconcentrada para indicar que a água ainda está presente. A Tg 'da formulação crioconcentrada é facilmente medida por calorimetria de varrimento diferencial (DSC), ver o passo 7.
2. Ajustar os parâmetros do processo de liofilização de modo a que a temperatura da amostra é sempre abaixo da Tg da amostra e que a pressão na câmara permite um rápido sublimação do gelo, ou seja, a secagem primária e a água residual na formulação, isto é, derivado secagem. Se a temperatura da amostra é acima da Tg ', durante o processo de secagem não é um grande risco de colapso estrutural da amostra, que podem diminuir significativamente a sobrevivência celular.
3. Para proteger os produtos secos após freeze-secagem a atmosfera da amostra tem de ser controlada. Se possível, selar as amostras no liofilizador antes de o vácuo é libertado no final do ciclo de secagem por congelação. Alternativamente, os frascos podem ser preenchido com uma atmosfera preferido. É importante evitar a exposição das amostras para as condições ambientais como a humidade ou o oxigénio presente na atmosfera de armazenamento irão influenciar a sobrevivência das células.
4. Pesar os frascos.

5. Reidratação

1. Rehidratar as amostras com água desionizada e estéril. A quantidade de água a ser adicionada deve ser a mesma que a quantidade removida durante a liofilização e é calculado a partir do peso do frasco vazio, o mesmo frasco com a amostra antes e após a liofilização. Vortex as amostras de vez em quando, em seguida, até as soluções aparecem homogênea.

6. Enumeração

1. Desenhar 100 ul de cada amostra e fazer 10 diluições em série. A partir das diluições de inte100 l resto é revestida em placas de TSA. As placas são incubadas à temperatura e tempo requerido.

7. Caracterização da formulação do comportamento de congelamento

1. Pegue uma pequena quantidade, 5 - 10 mg, da amostra e colocá-lo em uma panela DSC-alumínio com tampa. Prepare uma panela vazia como referência.
2. Definir o programa de verificação de temperatura DSC. O programa de arrefecimento é ajustado para imitar o passo de congelação no programa de liofilização. Isto é feito, como a cinética de arrefecimento pode influenciar a Tg 'das formulações hidratadas. Antes do exame de aquecimento começa reduzir a temperatura bem abaixo da Tg esperado 'das formulações investigadas, normalmente -100 ° C.
3. Escolher uma taxa adequada de aquecimento, normalmente, uma taxa de aquecimento de 5 - 40 ° C / min é usada. O sinal de fluxo de calor registada é expressa em watts e será influenciada pela taxa de aquecimento. A taxa de aquecimento maior irá dar um sinal maior de Tg.
4. Defina o intervalo de temperatura para que eut abrange tanto Tg 'ea fusão da formulação.

8. As medições de tensão de superfície das formulações hidratadas

1. A configuração experimental utilizado nesta experiência é de acordo com o método para medir du NOUY superfície.
2. Limpar o anel de platina e o vaso de medição com cuidado. O navio é lavado com acetona, limpou com um pano que não solte fiapos, e depois queimado no interior com uma chama incolor. O anel brilha em vermelho em uma chama incolor.
3. Encha o copo com a solução e deixar a superfície resolver antes da medição. Para soluções, onde o estado de equilíbrio é atingido apenas após um longo período de tempo, por exemplo, polímeros, a configuração simples usado aqui irá fornecer dados qualitativos.
4. Para as formulações com elevadas viscosidades, por exemplo, soluções de 2% (w / w) de HEC ou HPMC, a tensão superficial tem de ser medida em soluções de concentrações mais baixas e, em seguida, extrapolada. Isto pode ser feito, aproveitando o factoà diminuição dos níveis de tensão superficial de folga em concentrações inferiores a 0,5% (w / w).

9. Análise de raios X das formulações secas

1. Pegue uma pequena quantidade de matriz / bactérias e carregá-lo em um porta-amostras.
2. Monte o suporte de amostras para o X-ray-difratômetro.
3. Para analisar qualquer fase cristalina presente na amostra, o pacote de programas de EVA da Bruker pode ser usado.

10. Microscopia Eletrônica

1. Pegue uma pequena quantidade de matriz / bactérias para fora dos frascos e corrigi-lo em um suporte de SEM.
2. Carregue o titular SEM no crepitar-coater (Thermo polaron VGScientific SC7640 utilizado no presente trabalho) e casaco da amostra com alguns nm de Au / Pd ou Pt. Nestas experiências, os parâmetros de pulverização foram: 1900 V, 20 mA, e 20 seg, para a ~ 5 - 10 nm revestimento Au / Pd. O revestimento reduz a carga elétrica, durante a aquisição da imagem. Recomenda-se começar com uma camada fina e, se o carregamento persiste e provoca imagemartefactos, a amostra deve ser revestido novamente.
3. Carregar o titular SEM SEM na câmara. Selecione os parâmetros de imagem apropriados. Para o instrumento utilizado na Figura 2 (FEI Strata DB235), foram utilizados 5 kV voltagem de aceleração, spotsize 3, a uma distância de trabalho de 5 mm e o detector de electrões secundários.
4. Opcionalmente, é possível a utilização de feixe de iões focado para cortar secções transversais das bactérias incorporados no polímero para revelar mais pormenores.

Resultados

A Tabela 1 mostra dados sobre a composição da formulação, eventos gravados térmicas por DSC durante o aquecimento das formulações congeladas, a estrutura das amostras secas e a tensão superficial das soluções de formulação. A T _g »de sacarose ter sido determinada a -40 ° C, ^{2, 3} e pode ser difícil de detectar concentrações de sacarose para abaixo de 20% w / w. A ocorrência térmica a -35 ° C, é, provavelmente, relacionado com o aparecimento de dissoluç...

Discussão

A motivação para este estudo foi investigar algumas propriedades de formulação que podem ser de grande importância para a sobrevivência da célula durante a liofilização. Embora a tolerância secagem intrínseco varia entre as diferentes espécies, tal como ilustrado na Figura 1A, a tendência de quão bem a formulações diferentes suporte a sobrevivência das células é semelhante. É informativo começar com uma comparação de sacarose e Ficoll. Acredita-se que um factor-chave para uma form...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.