細菌の凍結乾燥と細胞の生存への影響のための処方

要約

凍結乾燥は、多くの場合、生菌細胞の乾燥製品を得るための簡単​​で便利な方法です。プロセスの問題は、細胞生存ある。ここで我々は細部、凍結乾燥時の細胞の生存が使用製剤の特性によって影響されるか調査する手順を。

要約

セルラ水を可逆的に保管を容易にするために、微生物を不活性化するために除去することができる。除去のそのような方法の一つは、穏やかな脱水方法考えられる凍結乾燥である。乾燥中の細胞生存を促進するために、細胞は、しばしば、予め処方される。製剤は、細胞を埋め込み、凍結乾燥中のセルに課される種々の有害なストレスからそれらを保護マトリックスを形成する。ここでは、凍結乾燥後の細胞の生存率を評価する一般的な方法を提示し、我々は、4つの異なる処方で得られた結果と比較することによってそれを示している：二糖スクロース、ポリマーフィコールPM400由来のスクロースを、各多糖類、ヒドロキシエチルセルロース（HEC細菌の2株、P.上）とヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、 プチダ KT2440とA. chlorophenolicus A6。本研究では、凍結乾燥用製剤を調製する方法と、機械式を調査する方法を示し示差走査熱量測定（DSC）、表面張力の測定は、X線分析、および電子顕微鏡を用いて、生存率にそれらのデータを関連付ける製剤を特徴付けることによって再水和後の細胞生存のイズム。ポリマーは、程度の差は、それぞれの多糖類に似た白糖の単量体構造を得るために選ばれました。この方法の設定を用いて、我々は、ポリマーは、製剤の特定の物理的特性が制御される場合、二糖類¹と効果的に細胞生存をサポートできることを示した。

プロトコル

1。 P.の栽培と収穫プチダ

1. Pのコロニーをトリプシン大豆ブロス100mlの（TSB）を接種することによりシュードモナスのスターター培養を準備プチダ細胞は、トリプシン大豆ブロス（TSA）を補充した培地で培養した。 130 rpmで設定揺れボードに30℃で文化を保つ。
2. 7時間後は、新鮮なTSB-培地に本培養の最終容量のスターター培養と同等の1/10〜アリコートを転送します。 16時間130 rpmで振盪ボードに30℃で細胞を保管してください。
3. 成長の16時間後、細胞を室温で20分間、1,500 xgで細胞培養物を回転させて回収する。上清を除去し、細胞ペレットを増殖培地に等張であるのNaCl溶液中で再懸濁することによって細胞を洗浄。この場合、150mMのNaCl溶液を用いた。 、次いで、細胞を再び遠心分離し、上清を処方培地で細胞を再懸濁する前にデカントステップ3.2を参照してください。

2。他の種の栽培

1. 他の細菌種にプロトコルを適合させるために栽培や収穫手順は、その種の要件に応じて変更されるべきである。収穫及び洗浄工程（複数可）中に細胞を取り扱う際浸透圧ショックを回避するために、溶液のオスモル濃度は、収穫時の増殖培地のことを一致させる必要がある。

3。細胞の策定

1. それぞれのマトリックス成分を計量することによって定式化ソリューションを準備し、水に溶解する。等張条件を達成するために、いずれかの賦形剤の量を調整したり、所望の重量オスモル濃度に到達するためのNaClまたはいくつかの他の細胞適合溶質を加える。このような二糖類などの低分子量物質の量は、容易に等張条件に達するように調整することができる。高分子であるポリマーのような物質については、張は、セルと互換性で調整する必要がありますリュート、 例えば塩化ナトリウムまたは二糖類。物質の任意の添加が交互に凍結乾燥挙動と細胞生存に影響を及ぼし得る製剤の物理的特性に影響を与えることに留意されたい。
2. 洗浄液（この場合、NaCl）を、それぞれの製剤のメディアで再懸濁細胞をデカント。
3. 細胞が均一に分散していることを確認します。高い粘度の配合物は、例えば 。、攪拌棒を添加し、均質な混合が達成されるまで、容器を振盪することにより混合して使用するのに対し、低粘度の配合物をボルテックスしている。
4. 凍結乾燥バイアルに処方を分ける。凍結乾燥中に除去される水の量を計算するために凍結乾燥前と後のバイアルを試料と、空の計量されるべきである。
5. バイアルを凍結乾燥機内に封入される場合はバイアルにゴム栓を追加するには、ステップ4.3を参照してください。
6. 凍結乾燥前に、各製剤中の細​​胞を列挙、ステップ6を参照してください。

4。フリーズドライ

1. 凍結乾燥条件は、配合物の物理的特性に調整されなければならない。最も重要なパラメータは、この場合、ガラス転移温度、Tgは、配合物、水が依然として存在であることを示すために、凍結濃縮試料についてのTg 'を付している。凍結濃縮製剤のTg 'を容易に示差走査熱量測定（DSC）を用いて測定され、ステップ7を参照してください。
2. 試料の温度は試料のTgを下回ると、チャンバ圧力は、すなわち、セカンダリ製剤中の氷、すなわち一次乾燥し、残留水を迅速に昇華を可能にすることを常にあるように、凍結乾燥プロセスのパラメータを調整する乾燥。試料温度は、乾燥プロセスの間に "Tgを超えている場合は有意に細胞の生存を減少させることができる試料の構造崩壊の大きな危険性がある。
3. fの後に乾燥した製品を保護するためにreeze乾燥サンプル雰囲気が制御されなければならない。可能であれば、真空凍結乾燥サイクルの終了時に解放される前に、凍結乾燥機でサンプルを密封する。あるいはバイアルは好ましい雰囲気を充填することができる。それは、ストレージ大気中の湿気や酸素の存在のような周囲条件にサンプルをさらすことを避けるために重要なのは、細胞の生存に影響を与える。
4. バイアル重量を量る。

5。水分補給

1. イオンと滅菌水でサンプルを再水和。添加する水の量は、凍結乾燥の間に除去し、空バイアル、凍結乾燥前と後の試料と同じバイアルの重量から計算される量とが同じでなければならない。サンプルは今、もう一度、次にソリューションが均質に表示されるまでボルテックス。

6。列挙

1. 各サンプルから100μlのを描画し、10倍連続希釈を行います。統合の希釈から残りの100μlをTSAプレート上にメッキされています。プレートは、必要な温度および時間でインキュベートする。

7。凍結挙動の定式化の特性

1. 少量、5取る - 10 mgの、サンプルのと蓋付きDSC-アルミパンで囲みます。リファレンスとして空の鍋を準備します。
2. DSC温度スキャンプログラムを設定します。冷却プログラムは、凍結乾燥番組で凍結工程を模倣するように設定されている。これは、冷却速度論のように行われる水和製剤のTg 'に影響を与えることができる。加熱スキャンによく、通常調査製剤の予想Tgが '、100℃以下の温度を下げる開始する前に
3. 40℃/分が使用されている - 適切な加熱速度、5の通常加熱速度を選択してください。記録された熱流量信号がワットで表され、加熱速度によって影響を受ける。高い加熱速度はTgが 'の大きな信号を与える。
4. 温度範囲を設定しているので、私tはTgが 'と製剤の融解の両方をカバーしています。

8。和製剤の表面張力測定

1. この実験で使用実験は、表面を測定するデュNoüy方法に従ってされる。
2. 慎重にプラチナリングと測定容器を清掃します。容器は、アセトンですすぎ、糸くずの出ないティッシュで拭いた後、無色の炎で内側に燃焼される。リングは無色の炎で赤点灯します。
3. 溶液を容器に記入し、表面が測定する前に解決することができます。平衡状態だけ久しぶりに達したソリューションについては、 例えばポリマーは、ここで使用される単純なセットアップでは定性的なデータを提供します。
4. 高い粘度、 例えば 2％の溶液（w / w）のHEC又はHPMCとの配合物については、表面張力が低い濃度の溶液で測定する必要があり、その後補外。これは、その事実を利用することによって行うことができる0.5％以下の濃度（w / w）の時の表面張力レベルオフの低下。

9。乾燥製剤のX線解析

1. マトリックス/細菌の少量を取り、サンプルホルダーにそれをロードします。
2. X線回折装置に試料ホルダーをマウントします。
3. サンプル内の任意の結晶相の存在を分析したBrukerからEVAプログラムパッケージを使用することができる。

10。電子顕微鏡法

1. バイアルのうちマトリックス/細菌の少量を取り、SEMスタブにそれを修正する。
2. スパッタコーター（本研究で使用するサーモVGScientificポーラロンSC7640）やコートのAu / Pd又はPtを数nmと、試料中のSEMホルダーをロードします。これらの実験ではスパッタのパラメータは次のとおりだった：1,900 V、20ミリアンペア、そして20秒〜5のために - は10nmのAu / Pdをコーティング。コー​​ティングは、画像取得時の電気の帯電を軽減します。充電が解消されないと、画像の原因となるかどうかは、薄いコーティングで開始することが推奨され、アーティファクトは、試料を再びコーティングされるべきである。
3. SEM室にSEMホルダーをロードします。適切な撮像パラメータを選択します。 図2（FEIストラータDB235）で使用される楽器のために私達は5 kVの加速電圧、スポットサイズ3、5ミリメートルと二次電子検出器の作動距離を使用していました。
4. 場合により、さらなる詳細を明らかにするためにポリマー中に埋め込まれた細菌の断面を切断するために集束イオンビームを使用することが可能である。

結果

製剤組成物、凍結製剤の加熱時にDSCによって記録された熱事象、乾燥試料の構造及び製剤溶液の表面張力の表1に表示されるデータである。スクロース_の Tg 'は-40°C ^2、図3に決定された、20％w / wの下方スクロース濃度を検出するために困難であり得る。 -35の熱イベント°Cは、おそらく氷の溶解²の発症に関連しています。結晶構造HECとHPMC試料でX?...

ディスカッション

この研究のための動機は、凍結乾燥中の細胞生存に重要であり得るいくつかの製剤特性を検討した。 図1A、異なる製剤の支持細胞の生存が類似している傾向にどれだけに示すように、真性乾燥耐性は、異なる種の間で変化するものの。それはスクロースおよびフィコールの比較で開始することが有益である。これは、細胞生存を支持するための製剤の重要な要因は、このように?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.