Formulierungen für die Gefriertrocknung von Bakterien und deren Einfluss auf Zellebensdauer

Zusammenfassung

Die Gefriertrocknung ist oft eine einfache und bequeme Möglichkeit, um trockene Produkte lebensfähiger Bakterienzellen zu erhalten. Ein Problem des Verfahrens ist das Überleben der Zelle. Wir hier ausführlich ein Verfahren zu untersuchen, wie das Überleben der Zelle während der Gefriertrocknung durch die Eigenschaften der verwendeten Formulierung beeinflusst wird.

Zusammenfassung

Cellular Wasser entfernt werden, um reversibel inaktiviert Mikroorganismen Lagerung zu erleichtern. Eine solche Methode der Entfernung ist die Gefriertrocknung, die als eine sanfte Dehydratisierung Verfahren. Um das Überleben der Zellen während des Trocknens zu erleichtern, werden die Zellen häufig formuliert vorher. Die Formulierung bildet eine Matrix, die die Zellen eingebettet und schützt sie vor verschiedenen schädlichen Belastungen der Zellen beim Einfrieren und Trocknen eingeführt. Wir stellen Ihnen hier eine allgemeine Methode, um die Überlebensrate der Zellen nach Gefriertrocknung bewerten und wir zeigen es durch den Vergleich der Ergebnisse mit vier verschiedenen Formulierungen erhältlich: das Disaccharid Saccharose, die Saccharose abgeleitet Polymer Ficoll PM400 und die jeweiligen Polysaccharide Hydroxyethylcellulose (HEC ) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), auf zwei Bakterienstämme, P. putida KT2440 und A. chlorophenolicus A6. In dieser Arbeit, die wir zeigen, wie Formulierungen für die Gefriertrocknung vorbereitet und wie man die mechanische untersuchenIsmen des Überlebens von Zellen nach der Rehydratation durch Charakterisierung der Formulierung unter Verwendung der Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC), Messungen der Oberflächenspannung, Röntgenstrukturanalyse und Elektronenmikroskopie und über diese Daten zu Überlebensraten. Die Polymere wurden gewählt, um eine monomere Struktur des jeweiligen Polysaccharids ähnlich Saccharose in unterschiedlichem Grad zu erhalten. Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass Setup Polymere können das Überleben der Zelle so effektiv zu unterstützen, wie Disaccharide wenn bestimmte physikalische Eigenschaften der Formulierung ¹ gesteuert werden.

Protokoll

1. Anbau und Ernte von P. putida

1. Bereiten Sie ein Starter-Kultur von Pseudomonas putida durch Impfen 100 ml CASO-Bouillon (TSB) mit einer Kolonie von P. putida Zellen auf Agar mit CASO-Bouillon (TSA) ergänzt kultiviert. Halten Sie die Kultur bei 30 ° C auf einem Schüttler bei 130 rpm Bord gesetzt.
2. Nach 7 Stunden einen aliquoten aus dem Starter-Kultur entspricht 1/10 der letzte Band der Hauptkultur an die frische TSB-Medium. Halten Sie die Zellen bei 30 ° C auf einem Schüttler bei 130 rpm Bord für 16 Stunden.
3. Nach 16 h des Wachstums werden die Zellen durch Drehen der Zellkultur bei 1.500 xg für 20 min bei RT geerntet. Man dekantiert die überstehende und die Zellen werden durch Resuspendieren des Zellpellets in einer NaCl-Lösung, isotonische zum Wachstumsmedium ist. In diesem Fall wird eine 150 mM NaCl-Lösung verwendet. Die Zellen werden dann einmal zentrifugiert und der Überstand vor dem Resuspendieren der Zellen in der Formulierung Medium dekantiert,siehe Schritt 3.2.

2. Der Anbau von anderen Spezies

1. Um das Protokoll zu anderen Bakterienarten passen sich die Anbau-und Ernteverfahren sollte entsprechend den Anforderungen dieser Art geändert werden. Einem osmotischen Schock zu vermeiden, wenn die Handhabung der Zellen während der Ernte und dem Waschschritt (e), muss die Osmolalität der Lösungen, die von dem Wachstumsmedium bei der Ernte entsprechen.

3. Formulierung von Zellen

1. Bereiten Sie die Formulierung Lösungen durch Abwiegen der jeweiligen Matrix-Komponenten und löst sie in Wasser. Um isotonischen Bedingungen zu erreichen, entweder einstellen, wie viel Hilfsstoff oder fügen NaCl oder eine andere Zelle kompatibel solute um den gewünschten Osmolalität zu erreichen. Für Stoffe mit niedrigem Molekulargewicht wie Disaccharide die Mengen können leicht angepasst werden, um isotonischen Bedingungen zu erreichen. Für Substanzen, wie Polymere, die mit hohem Molekulargewicht sind, hat die Tonizität mit Zelle kompatibel so eingestellt werden,Lauten, zB NaCl oder Disaccharide. Beachten Sie, dass jeder Zugabe einer Substanz, die physikalischen Eigenschaften der Formulierung, die ihrerseits Gefriertrocknen Verhalten und das Überleben der Zelle zu beeinflussen beeinflussen können.
2. Dekantieren der Waschlösung (in diesem Fall NaCl) und wieder die Zellen in der jeweiligen Formulierung Medien.
3. Stellen Sie sicher, dass die Zellen homogen verteilt sind. Formulierungen mit niedriger Viskosität werden verwirbelt während Formulierungen höhere Viskositäten gemischt verwenden, indem zB., Einen Rührstab und Schütteln des Behälters, bis eine homogene Durchmischung erreicht ist.
4. Teilen Sie die Formulierungen in Gefriertrockners Fläschchen. Die Ampullen sollte leer gewogen wird, mit der Probe vor und nach dem Gefriertrocknen, um die Menge von Wasser während der Gefriertrocknung entfernt berechnen.
5. In Gummistopfen auf den Fläschchen, wenn die Flaschen im Gefriertrockners abgedichtet werden, siehe Schritt 4.3.
6. Zählen Sie die Zellen in jeder Formulierung vor Gefriertrocknung, siehe Schritt 6.

4. Gefriertrocknung

1. Die Gefriertrocknung Bedingungen müssen mit den physikalischen Eigenschaften der Formulierung eingestellt werden. Der wichtigste Parameter ist dabei die Glasübergangstemperatur Tg der Formulierung bezeichnet Tg "für die Gefriertrocknung konzentrierte Probe, um anzuzeigen, dass das Wasser noch vorhanden ist. Die Tg 'der Gefriertrocknung konzentrierten Formulierung leicht wird mittels Differential Scanning Kalorimetrie (DSC), siehe Schritt 7.
2. Die Parameter des Gefriertrocknungsprozesses, so dass die Temperatur der Probe immer unterhalb der Tg der Probe und der Kammerdruck ermöglicht eine schnelle Sublimation des Eises, dh ersten Trocknung und Restwasser in der Formulierung, dh sekundäre Trocknen. Wenn die Temperatur der Probe oben Tg 'während der Trocknung gibt es ein großes Risiko der strukturellen Zusammenbruch der Probe, die erheblich verringern kann die zelluläre Überleben.
3. Um die trockene Produkte nach f schützenreeze-Trocknen der Probe Atmosphäre kontrolliert werden muss. Wenn möglich, dichten die Proben in den Gefriertrockner, bevor das Vakuum am Ende der Gefriertrocknung Zyklus freigegeben wird. Alternativ können die Phiolen können mit einer bevorzugten Atmosphäre gefüllt werden. Es ist wichtig zu vermeiden, dass die Proben an die Umgebungsbedingungen wie Feuchtigkeit oder Sauerstoff, die in dem Speicher Atmosphäre beeinflussen das Überleben der Zellen.
4. Wiegen Sie die Fläschchen.

5. Rehydrierung

1. Rehydrieren die Proben mit entionisiertem und sterilem Wasser. Die Menge an Wasser hinzugefügt werden sollte, dass gleich der Menge während der Gefriertrocknung entfernt und wird aus dem Gewicht des leeren Fläschchen derselben Küvette mit der Probe vor und nach dem Gefriertrocknen berechnet. Vortex die Proben hin und wieder dann, bis die Lösungen erscheinen homogen.

6. Enumeration

1. Zeichnen Sie 100 ul von jeder Probe und machen 10-fache serielle Verdünnungen. Von den Verdünnungen von inteRest 100 ul auf TSA-Platten ausplattiert. Die Platten werden bei der Temperatur und der Zeit, die erforderlich inkubiert.

7. Charakterisierung der Formulierung von Freezing Behavior

1. Nehmen Sie eine kleine Menge, 5 - 10 mg, der Probe und setzen Sie ihn in einem DSC-Aluminium-Pfanne mit Deckel. Bereiten Sie eine leere Pfanne als Referenz.
2. Stellen Sie die Temperatur DSC-Scan-Programm. Die Kühlung ist damit festgelegt, um den Gefrierpunkt Schritt der Gefriertrocknung Programm zu imitieren. Dies geschieht, da die Kühlung Kinetik der Tg 'der hydratisierten Formulierungen beeinflussen können. Bevor die Erwärmungsabtastung beginnt um die Temperatur weit unter dem erwarteten Tg "der untersuchten Formulierungen normalerweise -100 ° C.
3. Wählen Sie einen geeigneten Heizrate, normalerweise eine Heizrate von 5 - 40 ° C / min verwendet wird. Das aufgenommene Wärmestrom Signal wird in Watt und wird von der Aufheizgeschwindigkeit beeinflußt werden. Eine höhere Heizrate geben ein größeres Signal von Tg '.
4. Stellen Sie den Temperaturbereich, so dass icht gilt sowohl Tg 'und das Schmelzen der Formulierung.

8. Messungen der Oberflächenspannung der Hydrated Formulierungen

1. Der Versuchsaufbau ist in diesem Experiment verwendet wird, nach dem du Noüy Methode zur Oberfläche zu messen.
2. Reinigen Sie die Platin-Ring und die Meßgefäßes sorgfältig. Der Behälter wird mit Aceton gespült, wischte mit einem fusselfreien Tuch, und dann auf der Innenseite mit einer farblosen Flamme verbrannt. Der Ring leuchtet rot in einer farblosen Flamme.
3. Füllen Sie den Behälter mit der Lösung und lassen Sie die Oberfläche vor der Messung zu begleichen. Für Lösungen, bei denen der Gleichgewichtszustand erst nach langer Zeit erreicht ist, z. B. Polymere, wird das einfache Setup verwendet hier qualitative Daten.
4. Bei Formulierungen mit hohen Viskositäten, z. B. Lösungen von 2% (w / w) HEC oder HPMC weist die Oberflächenspannung auf Lösungen mit niedrigen Konzentrationen gemessen und extrapoliert. Dies kann durch die Tatsache zunutze gemacht, dassder Abfall der Oberflächenspannung einpendelt bei Konzentrationen unterhalb von 0,5% (w / w).

9. X-ray Analysis der trockenen Formulierungen

1. Nehmen Sie eine kleine Menge von Matrix / Bakterien und laden Sie es auf einem Probenhalter.
2. Montieren Sie den Probenhalter in die X-ray-Diffraktometer.
3. Um eine kristalline Phase in der Probe zu analysieren die EVA-Programmpaket von Bruker eingesetzt werden.

10. Electron Microscopy

1. Nehmen Sie eine kleine Menge von Matrix / Bakterien aus den Fläschchen und befestigen Sie es auf einem SEM Stummel.
2. Legen Sie die Halterung in der SEM Sputter-Coater (Thermo VGScientific Polaron SC7640 in der vorliegenden Arbeit verwendet) und Mantel der Probe mit einem wenige nm Au / Pd oder Pt. In diesen Experimenten wurde die Sputter-Parameter waren: 1900 V, 20 mA und 20 sec bei einer ~ 5 - 10 nm Au / Pd-Beschichtung. Die Beschichtung reduziert die elektrische Aufladung während der Bildaufnahme. Es wird empfohlen, mit einer dünnen Schicht beginnen und, wenn Aufladung besteht und bewirkt BildArtefakte, sollte die Probe erneut beschichtet werden.
3. Legen Sie die Halterung in der SEM SEM Kammer. Wählen Sie den entsprechenden Bildparameter. Für das Instrument in Abbildung 2 (FEI Strata DB235) verwendeten wir verwendet 5 kV Beschleunigungsspannung, Lichtfleck 3, einem Arbeitsabstand von 5 mm und der Sekundärelektronen-Detektor.
4. Optional ist es möglich, den fokussierten Ionenstrahl zu verwenden, um Querschnitte der Bakterien in dem Polymer eingebettet sind, um weitere Einzelheiten sichtbar zu machen.

Ergebnisse

Tabelle 1: Daten Formulierung Zusammensetzung thermischen Ereignisse durch DSC bei Erwärmung des gefrorenen Formulierungen Struktur der trockenen Proben und der Oberflächenspannung der Formulierung Lösungen aufgenommen. Die T _g 'von Saccharose auf -40 ° C ^{2, 3} festgelegt und kann schwierig sein, für Saccharose-Konzentrationen unter 20% w / w zu erkennen. Die thermische Ereignis bei -35 ° C wird wahrscheinlich zu Beginn der Eis Auflösung ² verwandt. Di...

Diskussion

Das Motiv für diese Studie war es, einige Eigenschaften, die Formulierung von Bedeutung für das Überleben der Zelle während der Gefriertrocknung kann untersuchen. Obwohl der innere Trocknung Toleranz variiert zwischen verschiedenen Spezies, wie in 1A, der Trend ab, wie gut die verschiedenen Formulierungen Unterstützung Zellüberleben ist ähnlich dargestellt. Es ist aufschlussreich, mit einem Vergleich der Saccharose und Ficoll starten. Es wird angenommen, dass ein wesentlicher Faktor für eine For...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.