Formulations pour la lyophilisation des bactéries et leur influence sur la survie des cellules

Résumé

La lyophilisation est souvent un moyen facile et pratique d'obtenir des produits secs de cellules bactériennes viables. Un problème de ce processus est la survie cellulaire. Nous détaillons ici une procédure pour étudier comment la survie des cellules pendant la lyophilisation est influencée par les propriétés de la formulation utilisée.

Résumé

Eau cellulaire peut être retiré pour inactiver les microorganismes réversible pour faciliter le stockage. Une telle méthode de suppression est la lyophilisation, qui est considéré comme une méthode de déshydratation douce. Pour faciliter la survie des cellules pendant le séchage, les cellules sont souvent préparées à l'avance. La formulation forme une matrice qui intègre les cellules et les protège contre divers stress nuisibles imposées sur les cellules lors de la congélation et le séchage. Nous présentons ici une méthode générale pour évaluer le taux de survie des cellules après lyophilisation et nous l'illustrons en comparant les résultats obtenus avec quatre formulations différentes: le saccharose disaccharide, le saccharose dérivé polymère Ficoll PM400, et les polysaccharides respectifs hydroxyéthylcellulose (HEC ) et de l'hydroxypropyl méthyl cellulose (HPMC), sur deux souches de bactéries, de P. putida KT2440 et A. A6 chlorophenolicus. Dans ce travail, nous illustrons comment préparer des formulations pour la lyophilisation et la façon d'enquêter sur la mécaniqueismes de la survie des cellules après réhydratation en caractérisant la formulation en utilisant la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), les mesures de tension de surface, analyse aux rayons X et microscopie électronique et concernant ces données à taux de survie. Les polymères ont été choisis de façon à obtenir une structure monomère de la saccharose ressemblant à de polysaccharide correspondant à un des degrés divers. En utilisant cette méthode setup nous avons montré que les polymères peuvent soutenir la survie cellulaire aussi efficacement que disaccharides si certaines propriétés physiques de la formulation sont contrôlées ^1.

Protocole

1. La culture et la récolte de P. putida

1. Préparer un levain de Pseudomonas putida par inoculation de 100 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) avec une colonie de P. putida cellules cultivées sur agar supplémenté avec du bouillon de soja tryptique (TSA). Gardez la culture à 30 ° C sur une planche en secouant fixé à 130 rpm.
2. Après 7 h de transférer une fraction aliquote de l'équivalent de levain à 1/10 du volume final de la culture principale pour BST-milieu frais. Gardez les cellules à 30 ° C sur une planche en agitant à 130 rpm pendant 16 heures.
3. Après 16 h de croissance, les cellules sont récoltées par centrifugation de la culture cellulaire à 1500 g pendant 20 min à température ambiante. Décanter le surnageant et laver les cellules par remise en suspension du culot cellulaire se trouve dans une solution de NaCl qui est isotonique pour le milieu de croissance. Dans ce cas, une solution de NaCl 150 mM a été utilisé. Les cellules sont ensuite centrifugées de nouveau et le surnageant est décanté avant la remise en suspension des cellules dans le milieu de formulation,voir l'étape 3.2.

2. La culture d'autres espèces

1. Pour adapter le protocole à d'autres espèces bactériennes les procédures de culture et de récolte doivent être modifiées en fonction des besoins de cette espèce. Pour éviter un choc osmotique lors de la manipulation des cellules pendant la récolte et l'étape de lavage (s), l'osmolalité des solutions doit correspondre à celle du milieu de culture à la récolte.

3. Formulation des cellules

1. Préparation des solutions de formulation en pesant les composants de la matrice respective et les dissoudre dans de l'eau. Pour obtenir des conditions isotoniques, soit régler la quantité d'excipient ou ajouter de NaCl ou d'un autre soluté compatible cellulaire pour atteindre l'osmolalité désirée. Pour les substances de faible poids moléculaire comme disaccharides les montants peuvent facilement être adaptées pour atteindre les conditions isotoniques. Pour les substances, comme les polymères qui sont de haut poids moléculaire, la tonicité doit être ajusté avec la cellule compatible siluths, par exemple NaCl ou disaccharides. Notez que toute addition d'une substance va influencer les propriétés physiques de la formulation, ce qui peut à son tour influencer le comportement lyophilisation et la survie cellulaire.
2. Décanter la solution de lavage (dans ce cas NaCl) et remettre en suspension les cellules dans les milieux de formulation respectifs.
3. Assurez-vous que les cellules sont dispersées de manière homogène. Les formulations de faible viscosité sont vortex alors que les formulations des viscosités plus élevées sont mélangés à l'aide en ajoutant, par exemple., Une barre d'agitation et agitant le récipient jusqu'à ce que le mélange homogène est atteint.
4. Répartissez les formulations dans des flacons lyophilisateur. Les flacons doivent être pesés vide, avec l'échantillon avant et après lyophilisation pour calculer la quantité d'eau éliminée lors de la lyophilisation.
5. Ajouter des bouchons en caoutchouc pour les flacons si les flacons doivent être scellés à l'intérieur du lyophilisateur, voir l'étape 4.3.
6. Énumérer les cellules dans chaque formulation avant la lyophilisation, voir l'étape 6.

4. La lyophilisation

1. Les conditions de lyophilisation doivent être ajustés aux propriétés physiques de la formulation. Le paramètre le plus important est dans ce cas la température de transition vitreuse, Tg, de la formulation, notée Tg 'de l'échantillon de gel-concentré pour indiquer que l'eau est encore présente. Le «Tg de la formulation gel concentré est facilement mesurée par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), voir l'étape 7.
2. Ajuster les paramètres du procédé de lyophilisation pour que la température de l'échantillon est toujours en dessous de la Tg de l'échantillon et que la pression de la chambre permet une sublimation rapide de la glace, c'est à dire le séchage primaire, et de l'eau résiduelle dans la formulation, à savoir secondaire séchage. Si la température de l'échantillon est au-dessus de Tg »pendant le processus de séchage il ya un grand risque d'effondrement de la structure de l'échantillon qui peut diminuer de façon significative la survie cellulaire.
3. Pour protéger les produits secs après freeze-séchage de l'atmosphère de l'échantillon doit être contrôlée. Si possible, sceller les échantillons dans le lyophilisateur avant le vide est libéré à la fin du cycle de lyophilisation. Alternativement, les flacons peuvent être remplis avec une atmosphère préféré. Il est important d'éviter d'exposer les échantillons à des conditions ambiantes comme l'humidité ou d'oxygène présent dans l'atmosphère de stockage va influencer la survie des cellules.
4. Peser les flacons.

5. Réhydratation

1. Réhydrater les échantillons avec de l'eau déminéralisée et stérile. La quantité d'eau à ajouter devrait être la même que la quantité prélevée au cours de la lyophilisation et est calculé à partir du poids du flacon vide, le même flacon avec l'échantillon avant et après lyophilisation. Vortex les échantillons de temps en temps alors que les solutions apparaissent homogène.

6. Enumeration

1. Dessinez 100 ul de chaque échantillon et réaliser des dilutions de 10 fois. A partir des dilutions de intereste 100 pi est plaquée sur des plaques de TSA. Les plaques sont incubées à la température et le temps requis.

7. Caractérisation de la formulation de gel Comportement

1. Prenez une petite quantité, 5 à 10 mg, de l'échantillon et placez-le dans une casserole DSC-aluminium avec couvercle. Préparer une casserole vide comme référence.
2. Réglez le programme de numérisation de température DSC. Le programme de refroidissement est réglé pour reproduire l'étape de congélation dans le programme de lyophilisation. Ceci est fait comme la cinétique de refroidissement peuvent influencer la «Tg des formulations hydratés. Avant la numérisation de chauffage commence faire baisser la température bien en dessous de la Tg attendue »des formulations étudiées, normalement -100 ° C.
3. Choisir un taux approprié de chauffage, normalement une vitesse de chauffage de 5 - 40 ° C / min est utilisé. Le signal de flux thermique enregistrée est exprimée en watts, et est influencé par la vitesse de chauffage. Une vitesse de chauffage plus élevée donnera un signal plus importante de Tg '.
4. Définissez la plage de température de sorte que it couvre à la fois «Tg et la fonte de la formulation.

8. Surface mesures de tension des formulations hydratées

1. Le dispositif expérimental utilisé dans cette expérience est conforme à la méthode du Noüy pour mesurer la surface.
2. Nettoyer la bague de platine et le récipient de mesure soigneusement. Le navire est rincé avec de l'acétone, essuyé avec un chiffon non pelucheux, puis brûlé à l'intérieur avec une flamme incolore. L'anneau devient rouge dans une flamme incolore.
3. Remplissez la cuve avec la solution et laissez la surface régler avant la mesure. Pour les solutions où l'état d'équilibre est atteint seulement après une longue période, par exemple des polymères, la configuration simple utilisé ici fourniront des données qualitatives.
4. Pour des formulations ayant des viscosités élevées, par exemple des solutions à 2% (p / p) HEC ou l'HPMC, la tension de surface doit être mesurée sur des solutions de concentrations plus faibles, et ensuite extrapolé. Cela peut être fait en profitant du fait quela baisse des niveaux de tension de surface au large à des concentrations inférieures à 0,5% (p / p).

9. L'analyse aux rayons X des formulations sèches

1. Prendre une petite quantité de matrice / bactéries et le charger sur un porte-échantillon.
2. Monter le porte-échantillon dans le X-ray-diffractomètre.
3. Pour analyser n'importe quelle phase cristalline présente dans l'échantillon du progiciel EVA de Bruker peut être utilisé.

10. Electron Microscopy

1. Prendre une petite quantité de Matrix / bactéries sur les flacons et le fixer sur un MEB.
2. Chargez le support SEM dans la pulvérisation coucheuse (Thermo Polaron VGScientific SC7640 utilisé dans le présent ouvrage) et le manteau de l'échantillon avec quelques nm de Au / Pd ou Pt. Dans ces expériences, les paramètres de pulvérisation étaient: 1,900 V, 20 mA et 20 sec, pour un ~ 5 - 10 nm de revêtement Au / Pd. L'enrobage permet de réduire la charge électrique au cours de l'acquisition d'image. Il est recommandé de commencer avec un revêtement mince et, si la charge persiste et provoque l'imageartefacts, l'échantillon doivent être enduites de nouveau.
3. Chargez le support SEM dans la chambre SEM. Sélectionnez les paramètres d'imagerie appropriées. Pour l'instrument utilisé dans la figure 2 (FEI Strata DB235), nous avons utilisé 5 tension d'accélération de kV, taille de mode 3, sur une distance de travail de 5 mm et le détecteur d'électrons secondaires.
4. En option, il est possible d'utiliser le faisceau d'ions focalisé pour couper des sections de la bactérie incorporés dans le polymère de révéler plus de détails.

Résultats

Le tableau 1 présente les données sur la composition de la formulation, des événements enregistrés par DSC thermiques pendant le chauffage des formulations congelées, de la structure des échantillons secs et de la tension superficielle des solutions de formulation. Le T _g 'de saccharose a été déterminé à -40 ° C ^{2, 3} et peut être difficile à détecter pour les concentrations de saccharose inférieure à 20% p / p. L'événement thermique à -35 ° C ...

Discussion

Le motif de cette étude était d'étudier certaines propriétés de formulation qui peuvent être d'importance pour la survie des cellules pendant la lyophilisation. Bien que la tolérance intrinsèque de séchage varie selon les espèces, comme illustré à la figure 1A, la tendance de la façon dont les formulations différentes soutien survie cellulaire est similaire. Il est instructif de commencer par une comparaison de saccharose et de Ficoll. On croit qu'un facteur clé pour une formu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.