ניסוחים להקפאת ייבוש של חיידקים והשפעתם על הישרדות תא

Summary

הקפאת ייבוש הוא לעתים קרובות דרך קלה ונוחה לקבלת מוצרים יבשים של תאים חיידקיים קיימא. נושא של התהליך הוא הישרדות תא. אנחנו נפרט כאן הליך לחקור כיצד הישרדות תא בתקופת הקפאת ייבוש מושפעת מהמאפיינים של הניסוח בשימוש.

Abstract

ניתן להסיר מים נייד כדי להשבית מיקרואורגניזמים הפיך כדי להקל על אחסון. שיטה אחת כזו היא של הסרת הקפאת ייבוש, הנחשב שיטת התייבשות עדינה. כדי להקל על הישרדות תא במהלך ייבוש, התאים לעתים קרובות מנוסחים מראש. הניסוח יוצר מטריצה ​​שמטביעה את התאים ומגן עליהם מפני לחצים מזיקים שונים המוטלים על התאים במהלך הקפאה וייבוש. אנו מציגים כאן שיטה כללית כדי להעריך את שיעור ההישרדות של תאים לאחר הקפאת ייבוש ולהמחיש את זה על ידי השוואת התוצאות שהושגו עם ארבעה ניסוחים שונים: סוכרוז disaccharide, סוכרוז נגזר פולימר Ficoll PM400, ואת סוכרים בהתאמה hydroxyethyl תאית (HEC ) וHydroxypropyl מתיל תאית (HPMC), בשני זנים של חיידקים, פ putida KT2440 וא ' A6 chlorophenolicus. בעבודה זו אנו מדגימים כיצד להכין ניסוחים להקפאת ייבוש וכיצד לחקור mechanהאיזמים של הישרדות תא לאחר התייבשות על ידי אפיון באמצעות הניסוח של קלורימטריה ההפרש סריקה (DSC), מדידות מתח פנים, בדיקת רנטגן, ומיקרוסקופ אלקטרונים והתייחסות לנתונים אלה שיעורי הישרדות. הפולימרים נבחרו כדי לקבל מבנה monomeric של סוכרוז הדומה פוליסכריד המתאים בדרגות שונות. שימוש בשיטת התקנה זו הראינו כי פולימרים יכולים לתמוך בהישרדות תא בצורה יעילה כמו disaccharides אם תכונות פיסיות מסוימות של הניסוח נשלטות ^1.

Protocol

1. טיפוח וקציר של פ putida

1. הכן את תרבות המתנע של Pseudomonas putida ידי inoculating 100 מ"ל של מרק סויה tryptic (TSB) עם מושבה של פ תאים בתרבית על putida אגר השלימו עם מרק סויה tryptic (TSA). שמור על התרבות על 30 מעלות צלזיוס על לוח רועד נקבע על 130 סל"ד.
2. לאחר 7 שעות להעביר aliquot ממקבילת תרבות המתנע עד 1/10 מהנפח הסופי של התרבות העיקרית לTSB-מדיום חדש. שמור את התאים ב 30 ° C על לוח רועד ב 130 סל"ד במשך 16 שעות.
3. לאחר 16 שעות של צמיחת התאים נקצרים על ידי ספינינג תרבית התאים ב 1500 XG במשך 20 דקות ב RT. למזוג supernatant לשטוף את התאים על ידי מחדש השעיית התא גלולה הוא בNaCl-פתרון הוא שוה למדיום הגידול. במקרה זה נעשה שימוש בפתרון 150 מ"מ NaCl. התאים אז centrifuged פעם נוספת והוא יצק את supernatant לפני resuspending התאים במדיום הניסוח,ראה שלב 3.2.

2. טיפוח של מינים אחרים

1. על מנת להתאים את הפרוטוקול למינים חיידקים אחרים יש לשנות את נהלי הטיפוח וקציר בהתאם לדרישות מאותו הזן. כדי להימנע מהלם האוסמוטי בעת טיפול בתאים בעת הקציר ושטיפת הצעד (ים), osmolality מפתרונות צריך להתאים את זה של מדיום הגידול בקציר.

3. ניסוח של תאים

1. הכן את פתרונות ניסוח על ידי שקילה את רכיבי המטריצה ​​המתאימים ולפזר אותם במים. כדי להשיג תנאים איזוטוניים, או להתאים את כמות החומר לא פעיל או להוסיף NaCl או מומס תואמת תא אחר כדי להגיע לosmolality הרצוי. לחומרים בעלי משקל מולקולרי נמוך כגון disaccharides יכולים בקלות להיות מותאמים הסכומים להגיע לתנאים איזוטוניים. לחומרים כמו פולימרים השל משקל מולקולרי גבוה, יש לו את tonicity להיות מותאם עם תא תואם כךמלה דומה באנגלית, למשל NaCl או disaccharides. שים לב שכל תוספת של חומר תשפיע על התכונות הפיסיקליות של הניסוח, אשר בתורו עשויים להשפיע על התנהגות הקפאת ייבוש והישרדות תא.
2. למזוג את פתרון הכביסה (במקרה זה NaCl) מחדש להשעות את התאים בתקשורת הניסוח המתאימה.
3. ודא כי התאים מפוזרים בצורה אחידה. ניסוחים של צמיגות נמוכה הם vortexed אילו ניסוחים של צמיגויות גבוהות יותר מעורבבים שימוש על ידי הוספה, למשל., בר ומערבב ומנער את המכל עד לערבוב אחיד מושגת.
4. לחלק את הניסוחים לתוך צלוחיות בהקפאת מייבש. את הבקבוקונים צריכים להישקל ריקים, עם מדגם לפני ואחרי הקפאת ייבוש כדי לחשב את כמות המים שהוסרה במהלך הקפאת ייבוש.
5. הוסף פקקי גומי לבקבוקונים אם את הבקבוקונים הם להיות אטומים בתוך הקפאת מייבש, ראה שלב 4.3.
6. למנות את התאים בכל ניסוח לפני הקפאת ייבוש, ראה שלב 6.

4. הקפאת ייבוש

1. תנאי הקפאת ייבוש צריכים להיות מותאמים למאפיינים הפיסיים של הגיבוש. הפרמטר החשוב ביותר הוא במקרה זה את טמפרטורת מעבר הזכוכית, TG, של הניסוח, Tg מסומן 'למדגם הקפאה המרוכז כדי לציין מים, כי הוא עדיין קיימים. "Tg של הגיבוש בהקפאה המרוכז נמדד בקלות באמצעות סריקת קלורימטריה ההפרש (DSC), ראה שלב 7.
2. התאם את הפרמטרים של תהליך הקפאת ייבוש כל כך את לחץ התא שהטמפרטורה של המדגם היא תמיד מתחת Tg של המדגם ושמאפשר לסובלימציה מהירה של קרח, כלומר ייבוש ראשוני, ושאריות מים בגיבוש, כלומר המשני ייבוש. אם הטמפרטורה היא מעל Tg המדגם "במהלך תהליך הייבוש קיים סיכון של קריסה מבנית של המדגם אשר עשויים להפחית באופן משמעותי את ההישרדות הסלולרית גדול.
3. על מנת להגן על המוצרים היבשים לאחר Freeze ייבוש אווירת המדגם חייבת להיות מבוקרים. במידת האפשר, לאטום את הדגימות בהקפאת מייבש לפני הוואקום הוא שוחרר בסופו של מחזור הקפאת הייבוש. לחלופין ניתן למלא את צלוחיות עם אווירה מועדפת. חשוב להימנע מלחשוף את הדגימות לתנאי הסביבה כמו כל לחות או בהווה חמצן באטמוספרה האחסון ישפיע על ההישרדות של התאים.
4. לשקול את הבקבוקונים.

5. התייבשות

1. רעננותם את הדגימות עם מים deionized וסטרילי. כמות המים שיש להוסיף שצריכה להיות זהה לסכום שהוסר במהלך הקפאת ייבוש ומחושב מהמשקל של בקבוקון הריק, אותו הבקבוקון עם דגימה לפני ואחרי הייבוש בהקפאה. מערבולת הדגימות עכשיו ושוב מאז ועד את פתרונות מופיעים הומוגנית.

6. מניה

1. צייר 100 μl מכל מדגם ולעשות דילולים סדרתי של פי 10. מהדילולים של Inteשאר μl 100 הוא מצופה בTSA-צלחות. הצלחות מודגרת על הטמפרטורה והזמן הנדרש.

7. אפיון של גיבוש התנהגות הקפאה

1. קח כמות קטנה, 5 - 10 מ"ג, של המדגם והקף אותו במחבת DSC-אלומיניום עם מכסה. הכן סיר ריק כנקודת התייחסות.
2. הגדר את תכנית סריקת טמפרטורת DSC. תכנית הקירור מוגדרת לחקות צעד ההקפאה בתכנית הקפאת הייבוש. הדבר נעשה כקינטיקה הקירור יכולה להשפיע "Tg של הניסוחים ההתייבשות. לפני סריקת החימום מתחילה להפיל את הטמפרטורה היטב מתחת Tg הצפוי "של הניסוחים שנחקרו, בדרך כלל -100 ° C.
3. בחר שיעור מתאים חימום, בדרך כלל שיעור חימום של 5 - 40 ° C משמש / דקה. אות זרימת החום נרשם מתבטאת בואט, ותושפע על ידי קצב החימום. שיעור חימום גבוה יותר ייתן אות גדולה יותר של Tg '.
4. הגדר את טווח הטמפרטורה, כך שאנילא מכסה גם 'Tg והתכה של הניסוח.

8. מדידות מתח פנים של הניסוחים Hydrated

1. הגדרת הניסוי בשימוש בניסוי זה היא לפי שיטת Noüy du למדוד פני השטח.
2. נקה את טבעת הפלטינה וכלי המדידה בזהירות. הכלי הוא שטף עם אצטון, ניגב בממחטת נייר נטולת מוך, ולאחר מכן שרפה בצד הפנימי עם להבה חסרת צבע. הטבעת זוהרת באדום להבה חסרת צבע.
3. מלא את הכלי עם הפתרון ולתת את פני השטח להתיישב לפני המדידה. לפתרונות שבו הוא הגיע למצב שיווי המשקל רק לאחר זמן רב, כגון פולימרים, ההתקנה הפשוטה משמשת כאן יספק מידע איכותי.
4. לניסוחים בעלי צמיגות גבוהה, פתרונות למשל של 2% (w / w), יש HEC או HPMC מתח הפנים כדי להימדד על פתרונות של ריכוזים נמוכים ולאחר מכן להסיק. ניתן לעשות זאת על ידי ניצול של העובדה שהירידה ברמות מתח הפנים יורדים בריכוזים נמוכים מ -0.5% (w / w).

9. ניתוח צילום רנטגן של הניסוחים יבשים

1. קח כמות קטנה של מטריצה ​​/ חיידקים ולטעון אותו על בעל מדגם.
2. הר בעל המדגם לקרן ה-X-diffractometer.
3. כדי לנתח כל שלב נוכחי גבישים במדגם יכול לשמש את חבילת תכנית EVA מברוקר.

10. מיקרוסקופית אלקטרונים

1. קח כמות קטנה של חיידקי מטריקס / מתוך המבחנות ולתקן אותה על בדל SEM.
2. טען בעל SEM בגמגום-coater (Thermo Polaron VGScientific SC7640 משמש בעבודה הנוכחית) ומעיל המדגם עם כמה ננומטר של Au / PD או Pt. בניסויים אלו הפרמטרים היו המקרטעים: 1,900 וולט, 20 אמפר, ו20 שניות, ל~ 5 - ציפוי Au / PD 10 ננומטר. הציפוי מפחית טעינה חשמלית במהלך רכישת תמונה. מומלץ להתחיל עם ציפוי דק, ואם טעינה נמשכת וגורמת לתמונהממצאים, המדגם צריך להיות מצופים שוב.
3. טען בעל SEM בתא SEM. בחר פרמטרים הדמיה מתאימים. למכשיר המשמש באיור 2 (פיי שכבות DB235) היינו 5 קילו וולט מתח ההאצה, 3 spotsize, מרחק עבודה של 5 מ"מ וגלאי אלקטרונים המשני.
4. לחלופין, ניתן להשתמש באלומת היונים הממוקד לחתוך חתכים של החיידקים המשובצים בפולימר לחשוף פרטים נוספים.

תוצאות

טבלה 1 מציגה נתונים על הרכב גיבוש, אירועים נרשמו על ידי תרמיות DSC במהלך חימום של ניסוחים קפואים, המבנה של הדגימות היבשות ומתח הפנים של פתרונות הניסוח. "T _גרם של סוכרוז נקבע ל-40 ° C ^{2, 3} והוא יכול להיות קשה לזהות לריכוזי סוכרוז מתחת ל -20% w / w. אירוע...

Discussion

המניע למחקר הנוכחי היה לבדוק כמה מאפייני ניסוח שעשויה להיות בעל חשיבות להישרדות תא בתקופת הקפאת ייבוש. למרות סובלנות הייבוש הפנימית משתנה בין מינים שונים, כפי שמודגם באיור 1 א, המגמה על כמה טוב הישרדות תא תמיכת ניסוחים שונה היא דומה. זה אינפורמטיבי להתחיל עם ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.