El trasplante ortotópico de intestino delgado en ratas

Resumen

Trasplante de intestino delgado se ha convertido en una opción terapéutica en los pacientes con fallo intestinal irreversible. Nuestro modelo experimental de trasplante ortotópico del intestino delgado en ratas sirve como una herramienta fiable para abordar inmunológica subyacente y los procesos inflamatorios que complicar el trasplante intestinal.

Resumen

Trasplante de intestino delgado se ha convertido en una opción aceptada clínica de los pacientes con síndrome de intestino corto y la falta de nutrición parenteral (fallo intestinal irreversible). En los centros especializados mejorado la gestión operativa y estrategias han llevado a excelente a corto y medio plazo paciente y la supervivencia del injerto al tiempo que proporciona alta calidad de vida ^1,3. A diferencia del trasplante más común de otros órganos sólidos (corazón, es decir, hígado) muchos mecanismos subyacentes de la función del injerto y las alteraciones inmunológicas inducidas por el trasplante intestinal no son del todo conocidos ^6,7. Los episodios de rechazo agudo, sepsis e insuficiencia crónica del injerto son los principales obstáculos aún menos favorable que contribuyen al resultado a largo plazo y dificultando un empleo más generalizado del procedimiento a pesar de un número creciente de pacientes con nutrición parenteral domiciliaria que potencialmente se beneficiarían de un trasplante. El intestino delgado contieneun gran número de leucocitos pasajeros comúnmente como parte del sistema linfoide asociado a intestino (GALT) esta siendo parte de la razón de la alta immunogenity del injerto intestinal. La presencia y la proximidad de muchos comensales y patógenos en el intestino explica la gravedad de los episodios de sepsis una vez integridad de la mucosa del injerto se ve comprometida (por ejemplo, rechazo). Para avanzar en el campo de datos intestinales y trasplante multiorgánico más generados a partir de modelos animales fiables y factibles que se necesita. El modelo que aquí combina la fiabilidad y viabilidad una vez establecido de una manera estandarizada y pueden proporcionar información valiosa en los subyacentes complejos mecanismos moleculares, celulares y funcionales que se activan mediante el trasplante intestinal. Hemos utilizado con éxito y perfeccionado el procedimiento descrito a lo largo de más de 5 años en nuestro laboratorio ^8-11. El JoVE basado en video formato es especialmente útil para demostrar el procedimiento complejoDuré y evitar los errores iniciales de los grupos de planificación para establecer un modelo de roedor ortotópico investigando el trasplante intestinal.

Protocolo

1. Donante de Operación

1. La rata donante debe mantenerse en ayunas durante 24 horas (acceso libre a una solución de agua / glucosa).
2. Para inducir la anestesia por inhalación isoflurano, comience con un 2% en atomizador estándar, y luego reducir a 1% después de realizar una laparotomía. Realice una pizca dedo para comprobar la sedación.
3. Afeitar el abdomen y limpiar con preparación de la piel 3 veces (Kodan). A continuación, realizar una incisión media después de la administración subcutánea del analgésico.
4. Después de que el injerto se envuelve en una gasa empapada en solución salina, separar las adherencias fisiológicas entre el páncreas y el colon ascendente suavemente con un Q-tip (bajo el microscopio quirúrgico con el aumento de 6x).
5. Ligar y dividir los vasos cólicos ileocecal y derecho y medio con 7-0 seda. Después de que el colon ascendente se extiende hacia el lado derecho de la vena mesentérica superior (SMV), los vasos cólicos ileocecal, central y derecha se pueden identificar para la ligadura y división, usando 7-0 lazos.
6. Retraer el estómago hacia arriba, de modo que la SMV todo se endereza y expuesta. Utilice una pinza mosquito para la retracción. La pinza se mantiene en masa de plastilina formado en forma según sea necesario.
7. Ligar y dividir las venas pancreático-duodenales procedentes de la SMV. Todos los pequeños pancreático-duodenales venas procedentes de la SMV debe identificarse cuidadosamente, se ligó con seda 7-0 y dividida antes de que el tejido pancreático se puede quitar desde el injerto.
8. Ligar y dividir el tejido conectivo incluyendo perder todos los vasos linfáticos entre el SMV y la aorta abdominal. Con la prótesis todavía en el lado derecho del abdomen, el perder tejido conectivo incluyendo todos los vasos linfáticos entre el SMV y la aorta abdominal es accesible. Este tejido conectivo deben ser ligados utilizando seda 7-0 y se divide para evitar linforrea postoperatoria del injerto intestinal.
9. Ligar y dividir la arteria renal derecha. Después de que el tejido conectivo se divide, la arteria renal derecha se convierte en accessible y se liga y se divide usando seda 7-0.
10. Sistémicamente heparinise la rata usando 200 unidades de heparina iv a través de la vena del pene.
11. Ligar las arterias marginales, y dividir el intestino delgado en la unión duodeno-yeyunal y en el íleon terminal.
12. La aorta se liga proximal al origen de la SMA. La vena porta se secciona en la confluencia con la vena esplénica. A continuación, el injerto se cosecha con su pedículo vascular que consiste de la SMA con un segmento de la aorta.

2. Procedimiento Backtable

1. Perfundir el injerto usando 3 ml de solución de la Universidad de Wisconsin (UW) a 4 ° C a través del conducto aórtico e irrigar el lumen intestinal desde el extremo yeyunal con 30 ml de Uro-Nebacetin solución de N a 4 ° C (lumen de irrigación es obligatorio) .

Inmediatamente después de extraer el injerto, el conducto aórtico se utiliza para la perfusión con 3 ml de solución fría de UW. Para ello, un 20 G iv catéter enuna jeringa de 10 ml se utiliza. El perfundido se debe observar para fluir libremente desde la vena portal dividido. Para la irrigación intestinal con Nebacetin, una jeringa de 50 ml se utiliza.

2. Almacenar el injerto en solución UW a 4 º C durante la preparación del receptor.

3. Receptor Operación

1. La rata receptora debe mantenerse en ayunas durante 24 horas (acceso libre a una solución de agua / glucosa).
2. Para inducir la anestesia por inhalación isoflurano, comience con un 2% en atomizador estándar, y luego reducir a 1% después de realizar una laparotomía. Realice una pizca dedo para comprobar la sedación.
3. Afeitar el abdomen y limpiar con preparación de la piel 3 veces (Kodan). A continuación, realizar una incisión media después de la administración subcutánea de Carprofen 5 mg / kg sc de analgesia.
4. Envuelva el recipiente en condiciones normales del intestino gasa empapada en solución salina y se coloca en el pecho del receptor.
5. Abra el retroperitoneo sin rodeos con Q-tips, y exponer el abdominal aorta y vena cava inferior justo por debajo de los vasos renales hasta el nivel de los vasos ilíacos, si es necesario también utilizar microtijeras. Se liga el tribuaries pequeñas espinal lumbar y de la aorta y la vena cava utilizando 7-0 seda para evitar la pérdida de sangre. (Para ello, cambie el zoom de 16x microscopio quirúrgico.)
6. Pinzamiento de la aorta y la vena cava inferior por debajo de la de los vasos renales proximales izquierdas y por encima de la bifurcación ilíaca distal utilizando clips de microvasos. Sólo una de las pinzas se utiliza proximalmente como distalmente así como para sujetar los dos buques simultáneamente. Una incisión ambos buques anteriormente utilizando un microknife y lavar la sangre restante.
7. Crear una anastomosis de extremo a lado entre el segmento aórtico injerto y la aorta infrarrenal del destinatario mediante una continua 10-0 sutura Prolene .. Inicialmente, el injerto se coloca en el lado derecho del abdomen (la cabeza de la rata colocada en las 12 horas) para realizar las puntadas de la pared posterior de la anastomosis arterial y la vinculación de la sutura estancia inferior. Then, el injerto se gira hacia el lado izquierdo del abdomen (la cabeza de la rata colocada en las 9 horas) para exponer y suturar la pared frontal de la anastomosis.
8. Una anastomosis de extremo a lado entre la vena porta y la vena cava inferior del injerto del destinatario se realiza igualmente mediante la ejecución de suturas utilizando 10-0 Prolene. Con la rata fijas situadas lateralmente (cabeza en posición de las 9), el injerto se coloca en el lado izquierdo del abdomen y una sutura de estancia inferior se coloca. La anastomosis se inicia con la pared posterior desde el interior del recipiente. Después de la sutura estancia inferior está ligado, las puntadas de la pared principal se puede realizar desde el exterior.
9. Retire las abrazaderas distales en primer lugar, seguidos de las abrazaderas superiores. Cualquier hemorragia anastomótica es controlado por la presión directa con un Q-tips. El injerto debe ser revisado por reperfusión igual y rápida.
10. Resecar el intestino delgado del receptor entero después de la ligadura de los vasos mesentéricos. Los beneficiarios se someten enterectomía subtotal, preservando 2-3 cm de proyeyuno ximal y 1 cm de íleon distal.
11. Restaurar la continuidad intestinal por proximal (yeyuno-yeyunostomía) y distal (ileo-ileostomía) de extremo a extremo utilizando una anastomosis intestinales interrumpido de una capa de sutura con 6-0 Monocryl. Aproximadamente 16 puntos de sutura se necesitan para completar las anastomosis.
12. Irrigar la cavidad peritoneal con solución salina normal hasta que esté limpia. Administrar 2 ml de solución salina normal por vía intraperitoneal para la reposición de líquidos. A continuación, cierre el abdomen con sutura continua con 3-0 Vicryl para la capa muscular más una sutura de la piel continua.
13. En el postoperatorio, las ratas se debe mantener en ayunas (con acceso al agua y una solución de glucosa) por otro de 24 horas luego reanudaron el estándar rata chow y agua ad libitum. Analgesia con carprofeno se debe administrar durante 3 días (ver dosis más adelante).

Resultados

Curso postoperatorio normal

Los animales trasplantados deben recuperarse rápidamente del procedimiento bajo una lámpara de calor durante aproximadamente 1 hora. La hipotermia es una causa importante de mortalidad postoperatoria y debe evitarse cuidadosamente intra-y postoperatorio. Pérdidas intraoperatorias de fluido debe ser sustituido por inyección subcutánea de 2,5 ml de solución salina normal más 2,5 ml de glucosa al 5% cada 8 horas durante las primeras 24 h. Las ratas también deben...

Discusión

Mientras que los modelos de trasplante intestinal en ratas se han descrito ya en el 1970ies ⁵ la mayoría de los modelos recientemente empleadas implican trasplante heterotópico intestinal utilizando diferentes técnicas ^13. Si bien los procedimientos heterotópico en general, tienen la ventaja de las técnicas de microcirugía más y más fácil accesibilidad del injerto para la evaluación, el trasplante heterotópico intestinal tiene la gran desventaja de no tener en cuenta las múltiples inter...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Universidad de Wisconsin (UW) solución (ViaSpan)	Bristol-Myers Squibb
Uro-N Nebacetin solución	Nycomed	6967855
Ampicilina	Ratiopharm
Carprofeno (Rimadyl)	Pfizer
10-0 sutura Prolene unresorbable	Ethicon
Monocryl 6-0 sutura reabsorbible	Ethicon
Vicryl 3-0 sutura reabsorbible	Ethicon
iv catéter G 20 mm 1.1x33	Braun
El catéter iv G 22 0.9x25 mm	Braun
Kodan Skin Prep	Schülke
Infusión NaCl 0,9% de solución	Braun
Pinzas curvas pequeña	FineScienceTools	11009-13
Micro pinzas curvas	AESCULAP	BD 333
Micro pinzas curvas	AESCULAP	FD281R
Micro Pinza recta 1	WPI	5
Micro Pinza recta 2	WPI	2
Soporte de la aguja Micro	WPI	14081
Micro tijeras	FineScienceTools	15006-09
Micro bisturí	MANI	Oftálmica cuchillo
Micro pinzas	AESCULAP	FB329R