Transplante de intestino delgado de ratos ortotópico

Resumo

Transplante de intestino delgado tornou-se uma opção de tratamento aceitável para os pacientes com falência intestinal irreversível. Nosso modelo experimental de transplante intestinal ortotópico pequena em ratos serve como uma ferramenta confiável para enfrentar imunológico subjacente e os processos inflamatórios que complicam o transplante intestinal.

Resumo

Transplante de intestino delgado, tornou-se uma opção clínico aceite para doentes com síndrome do intestino curto e insuficiência de nutrição parentérica (insuficiência intestinal irreversível). Em centros especializados melhorou operatório e estratégias de gestão levaram a paciente a curto e médio prazo e excelente sobrevida do enxerto, proporcionando alta qualidade de vida ^1,3. Ao contrário do transplante mais comum de outros órgãos sólidos (coração, fígado ou seja,) muitos mecanismos subjacentes da função do enxerto e alterações imunológicas induzidas por transplante intestinal não são totalmente conhecidos ^6,7. Episódios de rejeição aguda, septicemia e insuficiência crônica do enxerto são os principais obstáculos ainda contribuem para menos favorável resultado a longo prazo e dificultando um emprego mais amplo do procedimento, apesar de um número crescente de pacientes em nutrição parenteral domiciliar que potencialmente podem beneficiar de um transplante de tal. O intestino delgado contémum grande número de leucócitos passageiros comumente referida como parte do intestino associada sistema linfóide (GALT), esta sendo parte da razão para a alta immunogenity do enxerto intestinal. A presença ea proximidade de muitos comensais e patogénicos no intestino explica a gravidade dos episódios de sépsis, uma vez a integridade da mucosa do enxerto for comprometida (por exemplo, rejeição). Para avançar no campo de dados de múltiplos órgãos intestinais e transplante mais gerados a partir de modelos animais confiáveis ​​e viáveis ​​é necessário. O modelo aqui fornecida combina confiabilidade e viabilidade uma vez estabelecido de forma padronizada e pode fornecer informações valiosas nas subjacentes complexos moleculares, os mecanismos celulares e funcionais que são acionados por transplante intestinal. Nós temos utilizado com sucesso e refinado o procedimento descrito ao longo de mais de 5 anos no nosso laboratório ^8-11. O formato de vídeo baseado JoVE é especialmente útil para demonstrar o procedimento complexoDure e evitar as armadilhas iniciais para grupos de planejamento para estabelecer um modelo de roedor ortotópico investigando o transplante intestinal.

Protocolo

1. Operação doador

1. O rato dador devem ser mantidos em jejum durante 24 horas (acesso livre à água / solução de glicose).
2. Para induzir a anestesia inalatória de isoflurano, comece com 2% sobre atomizador padrão, e em seguida, reduzir para 1% após a realização de laparotomia. Realize uma pitada de igual para verificar sedação.
3. Raspar o abdômen e limpe com preparação da pele 3 vezes (Kodan). Em seguida, executar uma incisão mediana, após a administração subcutânea do analgésico.
4. Após o enxerto ser envolta em gaze embebida salina, separam-se as aderências fisiológicas entre o pâncreas e do cólon ascendente cuidadosamente com um Q-tip (sob o microscópio cirúrgico com ampliação 6x).
5. Ligadura e dividir os vasos cólica ileocecal e direita e meio usando 7-0 seda. Após o cólon ascendente foi espalhada para fora para o lado direito da veia mesentérica superior (SMV), os vasos de cólica ileocecal, direita e do meio pode ser identificado por ligadura e divisão usando 7-0 laços.
6. Retrair o estômago para cima, de modo que a totalidade SMV é endireitada para fora e exposta. Use uma pinça mosquito para a retração. O dispositivo de fixação é realizada em massa plasticina formado em forma, conforme necessário.
7. Ligadura e dividir as veias pancreatico-duodenais provenientes do SMV. Todas as pequenas veias pancreatico-duodenais provenientes do SMV deve ser cuidadosamente identificada, ligada com 7-0 seda e dividida antes do tecido pancreático pode ser removido a partir do enxerto.
8. Ligadura e dividir o tecido conjuntivo, incluindo todos os perder linfáticos e SMV entre a aorta abdominal. Com o enxerto ainda está do lado direito do abdómen, o tecido conjuntivo frouxo, incluindo todos os vasos linfáticos e SMV entre a aorta abdominal é acessível. Este tecido conjuntivo devem ser ligados utilizando 7-0 seda e dividido para evitar linforréia pós-operatória do enxerto intestinal.
9. Ligadura e dividir a artéria renal direita. Depois que o tecido conjuntivo é dividido, a artéria renal direita torna-se accessible e é ligada e dividida usando 7-0 seda.
10. Sistemicamente heparinise o rato, utilizando 200 unidades de heparina iv através da veia peniana.
11. Ligar as artérias marginais, e dividir o intestino delgado na junção duodeno-jejuno e no íleo terminal.
12. A aorta é ligada proximalmente para a origem da SMA. A veia porta é seccionado na confluência com a veia esplênica. Em seguida, o enxerto é colhida com o seu consistindo pedículo vascular da SMA com um segmento da aorta.

2. Procedimento Backtable

1. Perfundir o enxerto com 3 ml de solução da Universidade de Wisconsin (UW), a 4 ° C, através da conduta aórtica e irrigar o lúmen intestinal a partir do final do jejuno, com 30 ml de solução Nebacetin Uro-N, a 4 ° C (a irrigação do lúmen é obrigatório) .

Imediatamente após a extracção do enxerto, o conduto aórtico é utilizada para a perfusão, com 3 ml de solução gelada de UW. Para isto, um cateter de 20 G em ivuma seringa de 10 ml. O perfusato deve ser observada a fluir livremente para fora a partir da veia portal dividido. Para a irrigação intestinal com Nebacetin, uma seringa de 50 ml.

2. Armazene a solução de enxerto de UW, a 4 ° C durante a preparação do receptor.

3. Operação destinatário

1. O rato receptor devem ser mantidos em jejum durante 24 horas (acesso livre à água / solução de glicose).
2. Para induzir a anestesia inalatória de isoflurano, comece com 2% sobre atomizador padrão, e em seguida, reduzir para 1% após a realização de laparotomia. Realize uma pitada de igual para verificar sedação.
3. Raspar o abdômen e limpe com preparação da pele 3 vezes (Kodan). Em seguida, executar uma incisão mediana, após a administração subcutânea de carprofeno 5 mg / kg sc de analgesia.
4. Enrole o intestino destinatário em gaze embebida soro fisiológico e colocá-lo no peito do destinatário.
5. Abra o retroperitônio sem rodeios com Q-dicas, e expor a abdominal aorta ea veia cava inferior, logo abaixo dos vasos renais para baixo para o nível dos vasos ilíacos, se necessário também usar microtesoura. Ligar o tribuaries pequenas e lombar da coluna vertebral da aorta e veia cava usando 7-0 seda para evitar a perda de sangue. (Para fazer isso, altere o zoom microscópio cirúrgico até 16x.)
6. Atravesse-braçadeira a aorta ea veia cava inferior abaixo dos vasos renais esquerda proximal e acima da bifurcação ilíaca distalmente usando clipes de microvasos. Apenas uma braçadeira é utilizada proximal distal, bem como para fixar ambos os navios simultaneamente. Incisão ambos os navios anteriormente usando um microlanceta e lavar o sangue restante.
7. Criar uma anastomose término-lateral entre o segmento da aorta infra-renal da aorta do enxerto e do destinatário, usando uma sutura continua de prolene 10-0 .. Inicialmente, o enxerto é colocado no lado direito do abdómen (a cabeça do rato posicionado a 12 horas) para realizar os pontos da parede de trás da anastomose arterial e atar o fio de sutura inferior estadia. Then, o enxerto é virado para o lado esquerdo do abdómen (a cabeça do rato posicionado a 09:00), para expor e sutura da parede frontal da anastomose.
8. Anastomose término-lateral entre a veia porta do doador e do receptor IVC é realizada do mesmo modo, executando usando suturas 10-0 Prolene. Com o rato ainda lateralmente deitadas (cabeça na posição 9 horas), o enxerto é colocado no lado esquerdo do abdómen inferior e um fio de sutura é colocado estadia. A anastomose é iniciado com a parede do fundo do interior do vaso. Após a sutura está ligada estadia inferior, os pontos da parede frontal podem ser executadas a partir do exterior.
9. Remover os grampos distais primeiro lugar, seguido pelos grampos superiores. Qualquer sangramento anastomótico é controlada pela pressão direta usando Q-dicas. O enxerto deve ser verificado para igual e reperfusão rápida.
10. Ressecar intestino delgado do destinatário inteiro após a ligadura dos vasos mesentéricos. Destinatários enterectomizados subtotal, preservando 2-3 cm de projejuno ximal e 1 cm do íleo terminal.
11. Restaurar a continuidade entérico por proximal (jejuno-jejunostomia) e distal (íleo-ileostomia) de ponta a ponta anastomoses intestinais utilizando uma sutura interrompida uma camada com 6-0 Monocryl. Cerca de 16 pontos são necessários para completar as anastomoses.
12. Irrigar a cavidade peritoneal com solução salina normal até ficar limpo. Administrar 2 ml de soro fisiológico por via intraperitoneal para a reposição de líquidos. Em seguida, feche o abdômen com uma sutura contínua com Vicryl 3-0 para a camada muscular, mais uma sutura da pele contínua.
13. No pós-operatório os ratos devem ser mantidos em jejum (com acesso a água e uma solução de glucose) para um outro 24 hr depois reiniciado em dieta padrão e água ad libitum. Analgesia com carprofeno deve ser administrada durante 3 dias (ver dosagem abaixo).

Resultados

Evolução pós-operatória normal

Os animais transplantados deve se recuperar rapidamente do procedimento sob uma lâmpada de calor por cerca de 1 hora. A hipotermia é uma das principais causas de mortalidade no pós-operatório e devem ser evitados intra e pós-operatório. As perdas de fluido intra-operatória deve ser substituído por injeção subcutânea de 2,5 ml de solução salina normal mais 2,5 ml de glicose 5% a cada 8 horas para a primeira hora 24. Os ratos também devem ter livre...

Discussão

Embora os modelos de transplante de intestino de ratos têm sido descritos, o mais cedo no ⁵ 1970ies a maioria dos modelos recentemente utilizados envolvem transplante heterotópico intestinal utilizando diferentes técnicas ^13. Enquanto os procedimentos heterotópico em geral, têm a vantagem de técnicas de microcirurgia mais fáceis e mais fácil acessibilidade do enxerto para a avaliação, o transplante heterotópico intestinal tem a grande desvantagem de não levar em conta as múltiplas inte...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Universidade de Wisconsin (UW) solução (ViaSpan)	Bristol-Myers Squibb
Uro-Nebacetin solução N	Nycomed	6967855
Ampicilina	Ratiopharm
Carprofeno (Rimadyl)	Pfizer
Prolene sutura 10-0 unresorbable	Ethicon
Monocryl sutura reabsorvível 6-0	Ethicon
Fio de vicryl 3-0 reabsorvível	Ethicon
Cateter iv G 20 milímetros 1.1x33	Braun
Cateter iv G 22 0.9x25 milímetro	Braun
Kodan pele Prep	Schülke
Solução de NaCl a 0,9% Infusão	Braun
Fórceps curvos pequena	FineScienceTools	11009-13
Fórceps micro curvo	AESCULAP	BD 333
Fórceps micro curvo	AESCULAP	FD281R
Micro pinça reta 1	WPI	5
Micro pinça reta 2	WPI	2
Suporte da agulha micro	WPI	14081
Micro tesoura	FineScienceTools	15006-09
Micro bisturi	MANI	Faca oftálmica
Grampos Micro	AESCULAP	FB329R