Orthotopique transplantation d'intestin grêle chez le rat

Résumé

Transplantation d'intestin grêle est devenue une option thérapeutique reconnue pour les patients atteints d'insuffisance intestinale irréversible. Notre modèle expérimental de transplantation de l'intestin chez les rats petite orthotopique est un outil fiable pour répondre immunologique sous-jacente et les processus inflammatoires qui compliquent la transplantation intestinale.

Résumé

Transplantation d'intestin grêle est devenue une option clinique acceptée pour les patients atteints du syndrome de l'intestin court et l'échec de la nutrition parentérale (insuffisance intestinale irréversible). Dans les centres spécialisés amélioration opérationnelle et les stratégies de gestion ont conduit à un excellent court et à moyen terme patient et la survie du greffon tout en offrant une qualité de vie élevée ^1,3. Contrairement à la transplantation plus fréquente d'autres organes solides (c.-à-cœur, le foie), de nombreux mécanismes sous-jacents de la fonction du greffon et des modifications immunologiques induites par la transplantation intestinale ne sont pas entièrement connues ^6,7. Les épisodes de rejet aigu, septicémie et l'insuffisance chronique du greffon sont les principaux obstacles encore qui contribuent à moins favorable des résultats à long terme et d'entraver un emploi plus répandu de la procédure en dépit d'un nombre croissant de patients sous nutrition parentérale à domicile qui pourraient potentiellement bénéficier d'une telle greffe. L'intestin grêle contientun grand nombre de leucocytes passagers communément appelé dans le cadre de l'intestin système lymphoïde associé (GALT), cette partie étant la raison de la forte immunogénicité du greffon intestinal. La présence et la proximité de nombreux commensaux et pathogènes dans l'intestin, explique la sévérité des épisodes de septicémie fois greffe intégrité de la muqueuse est compromise (par exemple par le rejet). Pour faire avancer le domaine de l'informatique intestinales et la transplantation multiviscérale plus générés à partir de modèles animaux fiables et réalisables est nécessaire. Le modèle proposé ici combine à la fois la fiabilité et la faisabilité une fois établi dans une manière normalisée et peuvent fournir de précieuses informations sur les sous-jacents complexes moléculaires, les mécanismes cellulaires et fonctionnels qui sont déclenchés par transplantation intestinale. Nous avons utilisé avec succès et affiné la procédure décrite depuis plus de 5 ans dans notre laboratoire ^8-11. Le JoVE basé sur la vidéo format est particulièrement utile pour démontrer la procédure complexeDure et éviter les pièges initiaux pour les groupes envisagent d'établir un modèle de rongeur orthotopique enquête transplantation intestinale.

Protocole

1. Fonctionnement des bailleurs de fonds

1. Le rat donneur doit rester à jeun pendant 24 heures (accès libre à l'eau / solution de glucose).
2. Pour induire une anesthésie par inhalation isoflurane, commencez avec 2% pulvérisateur standard, puis réduire à 1% après avoir effectué une laparotomie. Effectuer un pincement de l'orteil pour vérifier la sédation.
3. Raser l'abdomen et le nettoyer avec préparation de la peau 3 fois (Kodan). Effectuez ensuite une incision médiane après administration sous-cutanée de l'analgésique.
4. Après la greffe est enveloppé dans de la gaze imbibée salée, séparer les adhérences physiologiques entre le pancréas et du côlon ascendant délicatement avec un coton-tige (sous le microscope chirurgical avec un grossissement de 6x).
5. Ligaturer et diviser les vaisseaux coliques iléo-cæcaux et droite et centre en utilisant 7-0 soie. Après le côlon ascendant est étalée sur le côté droit de la veine mésentérique supérieure (VMS), les vaisseaux coliques iléo-cæcaux, droite et centrale peuvent être identifiées pour la ligature et la division en utilisant 7-0 liens.
6. Rétracter l'estomac vers le haut, de sorte que l'ensemble de SMV est redressé et exposée. Utilisez une pince moustique de rachat. La pince est maintenue en masse à modeler mis en forme selon les besoins.
7. Ligaturer et diviser les veines pancréatico-duodénaux en provenance du SMV. Toutes les petites veines pancréatico-duodénaux provenant du SMV doit être soigneusement identifiée, ligaturé avec 7-0 soie et divisé avant que le tissu pancréatique peut être retiré de la greffe.
8. Ligaturer et diviser le tissu conjonctif perdent y compris tous les vaisseaux lymphatiques entre le SMV et de l'aorte abdominale. Avec la greffe toujours sur le côté droit de l'abdomen, la perte du tissu conjonctif, y compris tous les vaisseaux lymphatiques entre le SMV et de l'aorte abdominale est accessible. Ce tissu conjonctif doit être ligaturés en utilisant 7-0 soie et divisée pour éviter lymphorrhée postopératoire du greffon intestinal.
9. Ligaturer et de diviser l'artère rénale droite. Après le tissu conjonctif est divisé, l'artère rénale droite est accessible et est ligaturée et sectionnée en utilisant 7-0 soie.
10. Systémique heparinise le rat en utilisant 200 unités d'héparine iv dans la veine du pénis.
11. Ligaturer les artères marginales, et de diviser l'intestin grêle à la jonction duodéno-jéjunale et à l'iléon terminal.
12. L'aorte est ligaturé proximale à l'origine de la SMA. La veine porte est découpée à la confluence avec la veine splénique. Puis le greffon est récolté avec son pédicule vasculaire composé du SMA avec un segment aortique.

2. Procédure Backtable

1. Perfuser le greffage utilisant 3 ml de solution de l'Université du Wisconsin (UW) à 4 ° C par l'intermédiaire du conduit aortique et irriguer la lumière intestinale à partir de la fin du jéjunum avec 30 ml d'Uro-Nebacetin solution de N à 4 ° C (lumen d'irrigation est obligatoire) .

Immédiatement après l'extraction de la greffe, le conduit aortique est utilisé pour la perfusion avec 3 ml solution UW réfrigérés. Pour cela, un cathéter 20 G iv surune seringue de 10 ml est utilisé. La perfusion doit être observé pour s'écouler librement de la veine porte divisée. Pour l'irrigation intestinale avec Nebacetin, une seringue de 50 ml est utilisé.

2. Stocker le greffage en solution UW à 4 ° C au cours de la préparation du destinataire.

3. Fonctionnement du destinataire

1. Le rat receveur doit rester à jeun pendant 24 heures (accès libre à l'eau / solution de glucose).
2. Pour induire une anesthésie par inhalation isoflurane, commencez avec 2% pulvérisateur standard, puis réduire à 1% après avoir effectué une laparotomie. Effectuer un pincement de l'orteil pour vérifier la sédation.
3. Raser l'abdomen et le nettoyer avec préparation de la peau 3 fois (Kodan). Effectuez ensuite une incision médiane après administration sous-cutanée de carprofène 5 mg / kg sc peropératoire analgésie.
4. Enroulez le destinataire dans l'intestin normal de gaze imbibée solution saline et le placer sur la poitrine du destinataire.
5. Ouvrez le rétropéritoine carrément avec Q-tips, et exposer le abdominal aorte et la veine cave inférieure juste au-dessous des artères rénales vers le bas au niveau des vaisseaux iliaques, le cas échéant également utiliser microciseaux. Ligaturer les tribuaries petites lombaires et la colonne vertébrale de l'aorte et la veine cave en utilisant 7-0 soie pour éviter la perte de sang. (Pour ce faire, modifiez le zoom à 16x microscope chirurgical.)
6. Clampage de l'aorte et la veine cave inférieure au-dessous des vaisseaux rénaux proximal gauche et au-dessus de la bifurcation iliaque distal à l'aide des clips de microvaisseaux. Une seule pince est utilisée proximale distale ainsi que pour serrer les deux navires simultanément. Inciser les deux navires antérieurement en utilisant un microknife et laver le sang restant.
7. Créer une anastomose termino-latérale entre le segment aortique et aorte greffé le destinataire à l'aide d'un fil de suture continue 10-0 Prolene .. Initialement, le greffon est placé sur le côté droit de l'abdomen (la tête du rat placé à 12 heures) pour effectuer les points paroi arrière de l'anastomose artérielle et attachant de la suture inférieure séjour. Then, le greffon est mis sur le côté gauche de l'abdomen (la tête du rat placé à 9 heures) afin d'exposer et de suturer la paroi avant de l'anastomose.
8. Une anastomose termino-latérale entre la veine porte et IVC greffé du destinataire s'effectue également à l'aide de fils de suture en cours d'exécution 10-0 Prolene. Avec le rat fixes situées sur le côté (tête en position 9 heures), le greffon est positionné sur le côté gauche de l'abdomen et une suture inférieure séjour est placé. L'anastomose est démarré avec la paroi arrière de l'intérieur du récipient. Après la suture inférieure séjour est liée, les points paroi avant peut être effectuée à partir de l'extérieur.
9. Retirer les pinces distales d'abord, puis par les pinces supérieures. Tout saignement anastomotique est contrôlée par la pression directe à l'aide de coton-tiges. Le greffon doit être vérifiée reperfusion égale et rapide.
10. Réséquer l'intestin grêle du destinataire entière après la ligature des vaisseaux mésentériques. Les bénéficiaires subissent entérectomie montant, la préservation de 2-3 cm de projéjunum ximal et 1 cm d'iléon distal.
11. Rétablir la continuité entérique par proximale (jéjuno-jéjunostomie) et distale (iléo-iléostomie) de bout en bout à l'aide d'une anastomose intestinale interrompu une couche de suture avec 6-0 Monocryl. Environ 16 points de suture sont nécessaires pour compléter les anastomoses.
12. Rincer la cavité péritonéale avec une solution saline normale jusqu'à ce que propre. Administrer 2 ml de sérum physiologique par voie intrapéritonéale pour le remplacement des liquides. Ensuite, fermez l'abdomen à l'aide d'un surjet de Vicryl 3-0 avec la couche musculaire en plus d'une suture cutanée continue.
13. Dans la période postopératoire, les rats doivent être conservés à jeun (avec accès à l'eau et une solution de glucose) pour un autre h 24 puis redémarré le rat standard chow et eau ad libitum. Analgésie avec carprofène doit être administré pendant 3 jours (voir posologie ci-dessous).

Résultats

Cours normal des activités post-opératoire

Les animaux transplantés devrait se remettre rapidement de la procédure sous une lampe chauffante pendant environ 1 h. L'hypothermie est une cause majeure de mortalité postopératoire et doit être soigneusement évité intra-et postopératoire. Pertes liquidiennes intra-opératoires doivent être remplacés par injection sous-cutanée de 2,5 ml solution saline normale et de 2,5 ml de glucose 5% tous les 8 heures, pendant les 24 premières heu...

Discussion

Bien que les modèles de transplantation intestinale chez le rat ont été décrits dès le ⁵ 1970ies dans la plupart des modèles récemment utilisés impliquent hétérotopique transplantation intestinale en utilisant des techniques différentes ^13. Bien que les procédures hétérotopiques en général ont l'avantage de techniques de microchirurgie plus facile et plus facile accessibilité de la greffe d'évaluation, hétérotopique transplantation intestinale a le gros inconvénient de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Université du Wisconsin (UW) solution (ViaSpan)	Bristol-Myers Squibb
Uro-Nebacetin solution de N	Nycomed	6967855
Ampicilline	Ratiopharm
Carprofène (Rimadyl)	Pfizer
Prolene 10-0 suture unresorbable	Ethicon
Monocryl fil résorbable 6-0	Ethicon
Vicryl 3-0 suture résorbable	Ethicon
Cathéter IV G 20 mm 1.1x33	Braun
Cathéter iv G 22 0.9x25 mm	Braun
Kodan peau Prep	Schülke
Une solution de NaCl 0,9% perfusion	Braun
Pince courbes petite	FineScienceTools	11009-13
Micropincettes courbe	AESCULAP	BD 333
Micropincettes courbe	AESCULAP	FD281R
Micro Pince droite 1	WPI	5
Micro Pince droite 2	WPI	2
Porte-aiguille micro	WPI	14081
Ciseaux Micro	FineScienceTools	15006-09
Micro scalpel	MANI	Couteau ophtalmique
Micro pinces	AESCULAP	FB329R