El efecto sinérgico de la luz visible y gentamicina en<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Microorganismos

Resumen

Se demuestra que un dispositivo biomédico desarrollado que implica el tratamiento basado en láser visible continuo o pulsado que se combina con el tratamiento con antibióticos (gentamicina), da como resultado un efecto sinérgico estadísticamente significativa que conduce a una reducción en la viabilidad de los P. aeruginosa PAO1, el 8 de registro es en comparación con el tratamiento antibiótico solo.

Resumen

Recientemente hubo varias publicaciones sobre el efecto bactericida de la luz visible, la mayoría de ellos afirmando que parte azul del espectro (400 nm-500 nm) es responsable de matar a varios patógenos ^1-5. El efecto fototóxico de la luz azul se propuso ser el resultado de las especies reactivas de oxígeno inducidas por la luz (ROS) de formación de fotosensibilizadores bacterias endógenas que en su mayoría absorben luz en la región azul ^4,6,7. También hay informes de efectos biocidas de infrarrojos y zona de Red ^8, así como la luz verde ^9.

En el presente estudio, hemos desarrollado un método que nos ha permitido caracterizar el efecto de la luz Q-switched continua (CW) y pulsada (QS) de alta potencia verde (longitud de onda de 532 nm) de Pseudomonas aeruginosa. El uso de este método también estudiamos el efecto de la luz verde se combina con el tratamiento con antibióticos (gentamicina) en la viabilidad de las bacterias. P. aeruginosa es de corriente alternaommon noscomial patógeno oportunista que causa diversas enfermedades. La variedad es bastante resistente a varios antibióticos y contiene muchos predijeron tipo Mex AcrB / RND a múltiples sistemas de flujo de salida ^10.

El método utilizado fase bacterias Gram-negativas estacionarias de vida libre (cepa P. aeruginosa PAO1), cultivadas en caldo Luria (LB) expuesto a la conmutación de Q y / o láseres de CW con y sin la adición del antibiótico gentamicina. La viabilidad celular se determinó en diferentes puntos de tiempo. Los resultados obtenidos mostraron que el tratamiento con láser solo no redujo la viabilidad celular en comparación con el control no tratado y que el tratamiento con gentamicina sola sólo dio lugar a una reducción de 0,5 log en el recuento de viables para P. aeruginosa. El láser combinado y tratamiento con gentamicina, sin embargo, dieron lugar a un efecto sinérgico y la viabilidad de P. aeruginosa se ​​redujo en un 8 registro de.

El método propuesto puede ser más implementado a través del desarrollo de catéter como dispositivo capaz de inyectar una solución de antibiótico en el órgano infectado, mientras que al mismo tiempo que ilumina la zona de luz.

Protocolo

1. Cultura bacteriana

1. P. Gram-negativas aeruginosa cepa PAO1 se cultivaron en caldo Luria (LB) a 37 ° C durante 18 hr.
2. El cultivo de células se centrifugó a 7.500 rpm (revoluciones por minuto) durante 5 min y el sobrenadante se eliminó.
3. Las bacterias se resuspendieron en 10% LB y volver a crecer durante otras 2 h para permitir la cultura para volver a entrar fase estacionaria.
4. La suspensión de bacterias se dividió entonces en dos grupos: en el primer grupo (2 tubos) se añadieron ningún antibiótico, en el segundo grupo hemos añadido el antibiótico gentamicina (50 mg / ml).

2. Determinación de unidades formadoras de colonias (UFC)

1. Para determinar la viabilidad celular 20 l se tomaron muestras a partir del experimento aproximadamente cada 2 horas dentro del marco de tiempo de 24 horas. Dilución en serie de las muestras se hizo y se sembró en placas de agar LB y se incubó durante la noche a 37 ° C.
2. Para cada tratamiento, las UFC por plataformae se determinó y se hizo una comparación entre los períodos de tiempo y diversos tratamientos. La reducción log en UFC se calculó como se describe en la ecuación. (1):
   Iniciar reducción = Logu-logC [UFC / ml]
   Donde U es el valor de unidades formadoras de colonias en cada punto de tiempo; UFC es la unidad formadora de colonias, mientras que las unidades de UFC / ml igual a:
   UFC / ml = (número de colonias x factor de dilución) / (volumen inoculado)
   Y C es el UFC encontrado en la muestra de control en el tiempo de inicio. Tenga en cuenta que U designa el factor de formación de colonias en el instante de medición.
3. El factor de dilución es el número de diluciones, mientras que en cada uno de ellos la concentración de las bacterias se redujo por un factor de 10. El volumen inoculado fue siempre 200 litros micro y está relacionado con el tamaño de nuestra tubo de ensayo.

Por lo tanto, para resumir el punto de vista de la concentración, el antibiótico gentamicina fue a una concentración de 50 g / ml. En cuanto a las bacterias, hasta el final deel proceso que tuvo en general 8 diluciones. Cada dilución fue en un factor de 10 y se hizo en tubos de 200 l. El punto de partida fue 20 l de muestras añadido en el tubo 200 l (y por lo tanto la concentración inicial era 20/200C ₀ 0.1C0 con C = ₀ es la concentración inicial en la 20 l de muestras) y la concentración final fue reducido en un 8 órdenes de magnitud debido a las 8 diluciones.

3. Iluminación

1. CW láser Nd: YAG (longitud de onda de 532 nm y potencia óptica media de 200 mW) se dividió en dos trayectorias ópticas usando óptica 50% / 50% divisor de haz. El diámetro del haz era de aproximadamente 10 mm. El tiempo de exposición fue de 24 horas.
2. Q-switched pulsos láser Nd: YAG (longitud de onda de 532 nm, potencia media de 300 mW y potencia de pico óptica de 2,5 MW) también se dividió en dos caminos usando óptica 50% / 50% divisor de haz. El diámetro de la mancha era de 6 mm. El ancho de pulso del láser de conmutación de Q fue de 6 ns y la tasa de repetición era 15Hz. Ladensidad de potencia promedio fue de 106 mW / cm ² y la densidad de potencia pico fue de 8,83 kW / mm ^2. El tiempo de exposición fue de 24 horas.

Tenga en cuenta que la suspensión bacteriana se agitó durante la irradiación y se mantuvo bajo condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento bacteriano (en todos los tubos no había medio de Caldo Luria para permitir que las bacterias crezcan).

Resultados

La configuración basada en láser se presenta esquemáticamente en la Figura 1. La primera condición experimental utiliza un CW láser de Nd: YAG que tiene longitud de onda de 532 nm (el segundo armónico de la Nd: YAG) y la potencia óptica media de 200 mW. Este haz se divide en dos trayectorias ópticas usando 50% / 50% divisor de haz óptico de tal manera que cada haz dividido tenía potencia de 100 mW. El diámetro del haz era de aproximadamente 10 mm y por lo tanto la densidad de potencia fue de ...

Discusión

La fototerapia ha sido un campo de investigación multidisciplinar avanzado en los últimos años emergentes como un enfoque prometedor para el tratamiento de numerosas enfermedades. En este contexto, el uso de la luz en el rango visible ha sido ampliamente estudiado. Por ejemplo, se ha encontrado que las heridas infectadas pueden ser curadas con mayor eficacia mediante la exposición a la luz visible intensa para fines de esterilización. El mecanismo de acción de este enfoque ha demostrado ser a través de la inducci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lauria Broth	Difco	241420
Gentamycin	Sigma	G1914
Bacto Agar	Difco	231710