L&#39;effet synergique de la lumière visible et sur Gentamycin<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Microorganismes

Résumé

Nous montrons qu'un dispositif biomédical développé impliquant un traitement par laser visible continu ou pulsé qui est combiné avec un traitement antibiotique (gentamicine), se traduit par un effet synergique statistiquement significative conduisant à une réduction de la viabilité de P. aeruginosa PAO1, de 8 journal âge, comparativement à un traitement antibiotique seul.

Résumé

Récemment, il ya eu plusieurs publications sur l'effet bactéricide de la lumière visible, la plupart d'entre eux affirmant que partie bleue du spectre (400 nm-500 nm) est responsable du meurtre de divers agents pathogènes ^1-5. L'effet phototoxique de la lumière bleue a été suggéré d'être le résultat d'espèces induites par la lumière réactives de l'oxygène (ROS) formation par photosensibilisants bactériennes endogènes qui absorbent la lumière principalement dans la région bleu ^4,6,7. Il existe également des rapports d'effet biocide de rouge et le proche infra-rouge ⁸ ainsi que la lumière verte ^9.

Dans la présente étude, nous avons développé une méthode qui nous a permis de caractériser l'effet d'une forte vert de puissance (longueur d'onde de 532 nm) d'une lumière continue (CW) et pulsé Q-switched (QS) sur Pseudomonas aeruginosa. En utilisant cette méthode, nous avons également étudié l'effet de la lumière verte combiné avec un traitement antibiotique (gentamicine) sur la viabilité des bactéries. P. aeruginosa est acommon noscomial pathogène opportuniste causant diverses maladies. La souche est assez résistant à divers antibiotiques et contient beaucoup prédisaient AcrB / Mex polychimiothérapie de type RND systèmes d'efflux ^10.

La méthode utilisée phase de bactéries Gram-négatives fixes libres (souche de P. aeruginosa PAO1), cultivés dans du bouillon de Luria (LB) exposés à Q-switched et / ou CW lasers avec et sans l'ajout de la gentamicine antibiotique. La viabilité cellulaire a été déterminée à différents points dans le temps. Les résultats obtenus ont montré que le traitement au laser seul ne réduit pas la viabilité cellulaire par rapport au témoin non traité et que le traitement de gentamicine seul seulement abouti à une réduction de 0,5 log dans le compte viable pour P. aeruginosa. Le laser combiné et le traitement de gentamicine, cependant, ont abouti à un effet de synergie et la viabilité de P. aeruginosa a été réduit de 8 journal de.

La méthode proposée peut en outre être mise enœuvre par le développement de cathéter comme dispositif capable d'injecter une solution antibiotique dans l'organe infecté tout en éclairant simultanément la zone de lumière.

Protocole

1. Culture bactérienne

1. P. Gram négatif aeruginosa souche PAO1 ont été cultivées dans du bouillon de Luria (LB) à 37 ° C pendant 18 heures.
2. La culture de cellules est ensuite centrifugé à 7500 rpm (tours par minute) pendant 5 min et le surnageant a été retiré.
3. Les bactéries ont été remises en suspension dans 10% LB et re-pousser pendant 2 heures pour permettre à la culture pénètre de nouveau dans la phase stationnaire.
4. La suspension de bactéries est alors divisé en deux groupes: dans le premier groupe (2 tubes) ont été ajoutés aucun antibiotique, dans le deuxième groupe, nous avons ajouté l'antibiotique gentamicine (50 pg / ml).

2. Détermination des unités formant colonie (UFC)

1. Pour déterminer la viabilité cellulaire de 20 échantillons ont été prélevés ul de l'expérience environ toutes les 2 heures dans le délai de 24 heures. Dilution en série des échantillons ont été faites et sur des plaques d'agar LB et incubé pendant une nuit à 37 ° C.
2. Pour chaque traitement, les CFU par plate a été déterminée et une comparaison a été faite entre les périodes et les différents traitements. La réduction logarithmique UFC a été calculée comme décrit dans l'équation. (1):
   Connexion réduction = Logu-LogC [CFU / ml]
   Où U est la formation de colonies valeur d'unités à chaque point de temps; UFC est une unité formant des colonies, tandis que les unités de CFU / ml égale à:
   CFU / ml = (nombre de colonies x facteur de dilution) / (volume inoculé)
   Et c est la CFU trouvé dans l'échantillon de contrôle au moment du départ. Notez que U désigne la formation de colonies facteur à l'instant de mesure.
3. Le facteur de dilution est le nombre de dilutions tandis que dans chacun d'eux la concentration des bactéries est réduite par un facteur de 10. Le volume inoculé était toujours 200 micro litres et elle est liée à la taille de notre tube à essai.

Donc pour résumer le point de vue de la concentration, l'antibiotique gentamicine était à une concentration de 50 ng / ml. En ce qui concerne les bactéries, jusqu'à la fin dele processus, nous avons eu ensemble 8 dilutions. Chaque dilution a été par un facteur de 10 et cela a été fait dans des tubes de 200 pi. Le point de départ était de 20 ul d'échantillons ajoutés dans le tube de 200 pi (et donc la concentration initiale était 20/200C ₀ = 0.1C0 avec C ₀ étant la concentration initiale en 20 pi d'échantillons) et la concentration finale a été réduit de 8 ordres de grandeur à cause des dilutions 8.

3. Illumination

1. CW Nd: YAG (longueur d'onde de 532 nm et une puissance optique moyenne de 200 mW) a été scindé en deux chemins optiques utilisant optique 50% / 50% diviseur de faisceau. Le diamètre du faisceau est d'environ 10 mm. La durée d'exposition était de 24 heures.
2. Q-switché à impulsions Nd: YAG (longueur d'onde de 532 nm, une puissance moyenne de 300 mW et une puissance de crête optique de 2,5 MW) est également divisé en deux chemins optiques à l'aide de 50% / 50% diviseur de faisceau. Le diamètre du spot était de 6 mm. La largeur d'impulsion du laser déclenché a été de 6 ns et la fréquence de répétition est 15Hz. Lela densité de puissance moyenne est de 106 mW / cm ² et la densité de puissance de crête est 8,83 kW / mm ^2. La durée d'exposition était de 24 heures.

Notez que la suspension bactérienne agité pendant l'irradiation et il a été maintenu dans des conditions de culture appropriées pour la croissance bactérienne (dans tous les tubes y avait moyen Luria Broth pour permettre aux bactéries de se développer).

Résultats

La configuration basée sur le laser est présentée schématiquement à la figure 1. La première condition expérimentale a utilisé un laser CW Nd: YAG de longueur d'onde de 532 nm (le second harmonique de Nd: YAG) et de la puissance optique moyenne de 200 mW. Cette poutre a été divisée en deux chemins optiques à l'aide de 50% / 50% diviseur de faisceau optique de telle sorte que chaque faisceau divisé eu puissance de 100 mW. Le diamètre du faisceau est d'environ 10 mm, et donc la d...

Discussion

La photothérapie a été un domaine de recherche multidisciplinaire de pointe au cours des dernières années émergents comme une approche prometteuse pour le traitement de nombreuses maladies. Dans ce contexte, l'utilisation de la lumière dans le domaine visible a été largement étudiée. Par exemple, il a été constaté que les plaies infectées peuvent être guéries plus efficacement en les exposant à la lumière visible intense à des fins de stérilisation. Le mécanisme d'action de cette approche a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lauria Broth	Difco	241420
Gentamycin	Sigma	G1914
Bacto Agar	Difco	231710