האפקט סינרגיסטי של אור וgentamycin הגלויים על<em&gt; Aeruginosa Pseudomona</em&gt; מיקרואורגניזמים

Summary

אנו מראים כי מכשיר ביו מעורב פיתחה טיפול לייזר מבוסס גלוי רציף או פעם שהוא בשילוב עם טיפול אנטיביוטי (gentamycin), גורם לאפקט סינרגיסטי מובהק סטטיסטי שמוביל לירידה בכדאיות של פ aeruginosa PAO1, על ידי 8 יומן בהשוואה לטיפול באנטיביוטיקה לבד.

Abstract

לאחרונה היו כמה פרסומים על השפעת bactericidal של אור הנראה, רובם בטענה כי חלק כחול של הספקטרום (400 nm-500 ננומטר) הוא אחראי להרג פתוגנים שונים ^1-5. השפעת phototoxic של אור הכחול הוצעה להיות תוצאה של מיני חמצן תגובתי המושרה אור (ROS) על ידי היווצרות פוטוסנסיטייזרים חיידקים אנדוגניים אשר רובם לקלוט אור באזור הכחול ^4,6,7. ישנם גם דיווחים על השפעת biocidal של אדום וליד אינפרא אדום ^8, כמו גם אור ירוק ^9.

במחקר הנוכחי, שפתחנו שיטה שאפשרה לנו לאפיין את ההשפעה של מתח גבוה ירוק (אורך גל של 532 ננומטר) אור Q-Switched רציף (CW) ופעם (QS) בPseudomonas aeruginosa. שימוש בשיטה זו אנחנו גם בחנו את ההשפעה של אור הירוק בשילוב עם טיפול אנטיביוטי (gentamycin) על כדאיות החיידקים. פ aeruginosa הוא acהפתוגן האופורטוניסטי noscomial ommon גורם למחלות שונות. הזן הוא די עמיד לאנטיביוטיקה שונות ומכיל רבים מסוג Mex חזה AcrB / RND multidrug מערכות זרימה ^10.

השיטה מנוצל חיידקים נטולי חיים נייחים שלב גראם שליליים (עמ 'זן aeruginosa PAO1), גדלו במרק לוריא (LB) בינונית חשוף לQ-Switched ו / או CW לייזרים עם ובלי התוספת של gentamycin האנטיביוטי. כדאיות תא נקבעו בנקודות זמן שונות. התוצאות שהתקבלו הראו כי טיפול לייזר לבד לא להפחית כדאיות תא בהשוואה לשליטת מטופל וכי טיפול gentamycin לבד רק הביאה לירידה של 0.5 לוג בספירה המעשית עבור פ aeruginosa. לייזר המשולב וטיפול gentamycin, לעומת זאת, הביאו לאפקט סינרגיסטי ואת הכדאיות של פ aeruginosa הופחת ב 8 היומן של.

השיטה המוצעת יכולה להיות עוד יותר impleעינה באמצעות פיתוח של צנתר כמו מכשיר שמסוגל הזרקת תמיסת אנטיביוטיקה לתוך האיבר הנגוע בזמן מאיר את האזור באור בו זמנית.

Protocol

1. תרבות חיידקים

1. פ גראם שלילי aeruginosa זן PAO1 גדלו במרק לוריא (LB) על 37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות.
2. התרבות של תאים הייתה אז centrifuged ב 7,500 סל"ד (סיבובים לדקה) במשך 5 דקות וsupernatant הוסר.
3. החיידקים היו resuspended ב10% LB מחדש גדלו במשך שעה 2 אחרת כדי לאפשר התרבות להזין מחדש שלב נייח.
4. ההשעיה החיידקים לאחר מכן לחלק לשתי קבוצות: בקבוצה הראשונה (2 צינורות) אין אנטיביוטיקה נוספו, בקבוצה השנייה הוספנו את האנטיביוטיקה gentamycin (50 מיקרוגרם / מ"ל).

2. נחישות של מושבה יוצרי יחידות (CFU)

1. כדי לקבוע כדאיות תא 20 דגימות μl נלקחו מהניסוי בערך כל שעה 2 במסגרת הזמן של 24 שעות. דילול סידורי של הדגימות נעשו ומצופה על צלחות אגר LB וטופחו לילה בשעה 37 ° C.
2. עבור כל טיפול, CFUs לפלאטהדואר נקבע ונערכה השוואה בין תקופות הזמן שונים וטיפולים. הירידה ביומן CFU חושב כמתואר במשוואה. (1):
   התחבר הפחתה = LogU-LogC [CFU / מ"ל]
   איפה U הוא המושבה להרכיב יחידות ערך בכל נקודת זמן; CFU הוא יחידת מושבה היוצרים בעוד שהיחידות של CFU / מ"ל ​​שווה ל:
   CFU / מ"ל ​​= (מספר הגורם לדילול מושבות x) / (נפח מחוסן)
   ו-C הוא CFU מצא במדגם השליטה בשלב ההתחלה. שימו לב שU מייעד מושבה להרכיב גורם ברגע מדידה.
3. הגורם לדילול הוא מספר דילולים ואילו בכל אחד מהם את ריכוז החיידקים צומצם בפקטור של 10. הנפח מחוסן תמיד היה 200 ליטר מיקרו וזה קשור לגודל של מבחנתנו.

לכן, כדי לסכם את נקודת מבט של הריכוז, האנטיביוטיקה gentamycin הייתה בריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל. באשר לחיידקים, עד סוףהיה לנו התהליך כולל 8 דילולים. כל דילול היה בפקטור של 10 וזה נעשה בצינורות של 200 μl. נקודת המוצא הייתה 20 μl של דגימות שנוספו לתוך צינור μl 200 (ובכך הריכוז הראשוני היה 20/200C ₀ = ₀ 0.1C0 עם C להיות הריכוז הראשוני ב20 μl של דגימות) והריכוז הסופי הופחת 8 סדרי גודל בשל דילולים 8.

3. תאורה

1. CW Nd: YAG לייזר (אורך גל של 532 ננומטר וכוח אופטי הממוצע של 200 מגה ואט) פוצל לשני נתיבים אופטיים באמצעות 50% אופטיים / 50% מפצל קורה. קוטר האלומה היה על 10 מ"מ. משך החשיפה היה 24 שעות.
2. Q-Switched פעם Nd: YAG לייזר (אורך הגל של 532 ננומטר, הספק ממוצע של 300 מגה ואט ושיא כוח אופטי של 2.5 מגה וואט) פוצל לשני נתיבים גם באמצעות 50% אופטיים / 50% מפצל קורה. קוטר הנקודה היה 6 מ"מ. הרוחב פולס של לייזר ממותגת Q היה 6 NSEC ושיעור ההישנות היה 15Hz.צפיפות הספק ממוצעת הייתה 106 mW / ² ס"מ ובצפיפות הספק השיא הייתה 8.83 קילוואט / ² מ"מ. משך החשיפה היה 24 שעות.

שים לב כי ההשעיה החיידקים עוררה במהלך הקרנה וזה היה כל הזמן תחת תנאי התרבות מתאימים להתפתחות חיידקים (בכל הצינורות היה בינונית מרק לוריא, כדי לאפשר לחיידקים לגדול).

תוצאות

ההתקנה מבוססת לייזר מוצגת סכמטי באיור 1. תנאי הניסוי הראשון מנוצלים Nd CW: YAG לייזר בעל אורך גל של 532 ננומטר (ההרמוני שני של Nd: YAG) וכוח אופטי ממוצע של 200 מגה ואט. קרן זו פוצלה לשני נתיבים אופטיים באמצעות 50% 50% מפצל אופטי כך שכל קורה לי פיצול כוח של 100 מגה ואט אלומה /. קו...

Discussion

פוטותרפיה כבר תחום מחקר רב תחומי מתקדם בשנים האחרונות מתפתחות כגישה מבטיחה לטיפול במחלות רבות. בהקשר זה את השימוש באור בטווח הגלוי, נחקר בהרחבה. כך, למשל, נמצא כי ניתן לרפא פצעים מזוהמים בצורה יעילה יותר על ידי חשיפתם לאור הנראה אינטנסיבי למטרות עיקור. מנגנון הפעולה ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lauria Broth	Difco	241420
Gentamycin	Sigma	G1914
Bacto Agar	Difco	231710