L&#39;effetto sinergico di luce visibile e Gentamicina su<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Microrganismi

Riepilogo

Mostriamo che un dispositivo biomedicale sviluppato comporta il trattamento laser basato visibile continua o pulsata che è combinato con il trattamento antibiotico (gentamicina), determina una statisticamente significativo effetto sinergico che porta a una riduzione della vitalità P. aeruginosa PAO1, da 8 diario di rispetto alla sola terapia antibiotica.

Abstract

Recentemente ci sono state diverse pubblicazioni sul effetto battericida della luce visibile, la maggior parte di loro sostenendo che parte blu dello spettro (400 nm-500 nm) è responsabile per l'uccisione di vari agenti patogeni ^1-5. L'effetto fototossica di luce blu è stato suggerito di essere il risultato di specie reattive dell'ossigeno luce-indotti (ROS) di formazione per fotosensibilizzanti batteriche endogene che per lo più assorbono la luce nella regione blu ^4,6,7. Ci sono anche segnalazioni di effetti biocidi del rosso e del vicino infrarosso ⁸ così come la luce verde ^9.

Nel presente studio, abbiamo sviluppato un metodo che ci ha permesso di caratterizzare l'effetto di verde ad alta potenza (lunghezza d'onda di 532 nm) Q-switched luce continua (CW) e ad impulsi (QS) su Pseudomonas aeruginosa. Con questo metodo abbiamo anche studiato l'effetto di luce verde in combinazione con il trattamento antibiotico (gentamicina) sulla vitalità dei batteri. P. aeruginosa è acCOMUNI noscomial patogeno opportunista che causa varie malattie. Il ceppo è abbastanza resistente a diversi antibiotici e contiene molti predetto AcrB / Mex-tipo RND multidrug sistemi di efflusso ^10.

Il metodo utilizzato fase stazionaria batteri Gram-negativi a vita libera (P. aeruginosa ceppo PAO1), coltivate in Luria Broth (LB) medio esposto a Q-switched e / o CW laser con e senza l'aggiunta del gentamicina antibiotico. La vitalità cellulare è stata determinata in punti temporali diversi. I risultati ottenuti hanno mostrato che il trattamento laser da solo non ha ridotto la vitalità cellulare rispetto al controllo non trattato e che il trattamento gentamicina sola solo portato a una riduzione 0,5 log nella conta vitale per P. aeruginosa. Il laser combinato e trattamento gentamicina, tuttavia, hanno comportato un effetto sinergico e la vitalità di P. aeruginosa è stato ridotto di 8 log di.

Il metodo proposto può essere ulteriormente attuaretato attraverso lo sviluppo di catetere come dispositivo in grado di iniettare una soluzione di antibiotico nell'organo infetto mentre simultaneamente illuminando la zona con luce.

Protocollo

1. Coltura batterica

1. P. Gram-negativi aeruginosa ceppo PAO1 sono state coltivate in Luria Broth (LB) a 37 ° C per 18 hr.
2. La coltura di cellule è stato quindi centrifugato a 7500 rpm (giri al minuto) per 5 minuti e il surnatante è stato rimosso.
3. I batteri sono stati risospesi in 10% LB e ri-crescere per un altro 2 ore per permettere alla cultura di rientrare fase stazionaria.
4. La sospensione batterica è stata poi divisa in due gruppi: nel primo gruppo (2 tubi) sono stati aggiunti nessun antibiotico, nel secondo gruppo abbiamo aggiunto l'antibiotico gentamicina (50 mcg / ml).

2. Determinazione delle unità formanti colonie (CFU)

1. Per determinare la vitalità cellulare 20 campioni microlitri sono stati prelevati da l'esperimento ogni 2 ore circa entro il termine di 24 ore. Diluizioni seriali dei campioni sono state fatte e placcato su piastre di LB agar ed incubata per una notte a 37 ° C.
2. Per ciascun trattamento, i CFU per ogni piattaformae stata determinata e stato effettuato un confronto tra i periodi di tempo e vari trattamenti. La riduzione login CFU è stato calcolato come descritto in Eq. (1):
   Entra riduzione = Logu-logC [CFU / ml]
   Dove U è il valore delle unità formanti colonie ad ogni tempo; CFU è l'unità formanti colonie mentre le unità di CFU / ml pari a:
   CFU / ml = (numero di colonie x fattore di diluizione) / (volume inoculato)
   E C è la CFU individuata nel campione controllo in fase di avviamento. U notare che designa il formanti colonia Fattore all'istante di misura.
3. Il fattore di diluizione è il numero di diluizioni mentre in ciascuna di esse la concentrazione dei batteri è stata ridotta di un fattore 10. Il volume inoculato era sempre 200 microlitri ed è relativo alla dimensione della nostra provetta.

Quindi per riassumere il punto di vista di concentrazione, la gentamicina antibiotico era a concentrazione di 50 ug / ml. Per quanto riguarda i batteri, fino alla fine delil processo che abbiamo avuto complessivamente 8 diluizioni. Ogni diluizione era di un fattore 10 ed è stato fatto in tubi da 200 microlitri. Il punto di partenza era di 20 pl di campioni aggiunti nel tubo 200 microlitri (e quindi la concentrazione iniziale era 20/200C ₀ = 0.1C0 con C _{0 è} la concentrazione iniziale in 20 pl di campioni) e la concentrazione finale è stato ridotto di 8 ordini di grandezza a causa delle diluizioni 8.

3. Illuminazione

1. CW laser Nd: YAG (lunghezza d'onda di 532 nm e potenza ottica media di 200 mW) è stata suddivisa in due percorsi ottici con ottica 50% / 50% divisore di fascio. Il diametro del raggio era di circa 10 mm. La durata di esposizione era di 24 ore.
2. Q-switched pulsato Nd: YAG laser (lunghezza d'onda di 532 nm, potenza media di 300 mW e potenza ottica massima di 2,5 MW) è stato diviso in due percorsi ottici utilizzando 50% / 50% divisore di fascio. Il diametro dello spot è di 6 mm. La larghezza degli impulsi del laser Q-switched era 6 nsec e la frequenza di ripetizione era 15Hz. Glidensità di potenza media era di 106 mW / cm ² e la densità di potenza di picco era 8,83 kW / mm ^2. La durata di esposizione era di 24 ore.

Si noti che la sospensione batterica agitata durante l'irraggiamento e fu mantenuta in condizioni di coltura appropriati per una crescita batterica (in tutte le provette c'era Luria Broth mezzo per permettere ai batteri di crescere).

Risultati

La configurazione basata laser viene presentata schematicamente nella figura 1. La prima condizione sperimentale utilizzato un CW laser Nd: YAG avente lunghezza d'onda di 532 nm (la seconda armonica della Nd: YAG) e della potenza ottica media di 200 mW. Questo fascio è stato diviso in due percorsi ottici utilizzando ottica 50% / 50% divisore di fascio tale che ciascun fascio scissione aveva potenza di 100 mW. Il diametro del raggio era di circa 10 mm e quindi la densità di potenza era di circa 100...

Discussione

La fototerapia è stata un campo di ricerca multidisciplinare avanzata negli ultimi anni emergono come un approccio promettente per il trattamento di numerose malattie. In questo contesto l'uso della luce nella gamma visibile è stata ampiamente studiata. Per esempio, si è scoperto che le ferite infette possono essere guariti più efficacemente esponendoli a luce intensa per scopi di sterilizzazione. Il meccanismo di azione di questo approccio è stato dimostrato di essere attraverso l'induzione di radicali del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lauria Broth	Difco	241420
Gentamycin	Sigma	G1914
Bacto Agar	Difco	231710