O efeito sinérgico da luz visível e no Gentamicina<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Microorganismos

Resumo

Mostra-se que um dispositivo biomédicas desenvolvida que envolve o tratamento a laser visível contínua ou pulsada que é combinado com o tratamento com antibióticos (gentamicina), resulta num efeito sinérgico significativo estatisticamente levando a uma redução da viabilidade da P. aeruginosa PAO1, por 8 log é comparado ao tratamento com antibióticos só.

Resumo

Recentemente houve várias publicações sobre o efeito bactericida da luz visível, a maioria deles alegando que parte azul do espectro (400 nm-500 nm) é responsável pela morte de vários patógenos ^1-5. O efeito fototóxico de luz azul foi sugerida para ser uma sequência de espécies reactivas de oxigénio induzido pela luz (ROS) por formação bacterianas endógenas fotossensibilizadores que absorvem a luz na maior parte da região azul ^4,6,7. Há também relatos de efeito biocida de vermelho e perto infra vermelho ^8, bem como luz verde ^9.

No presente estudo, foi desenvolvido um método que nos permitiu caracterizar o efeito da alta de energia verde (comprimento de onda de 532 nm) luz contínua (CW) e pulsou Q-switched (QS) em Pseudomonas aeruginosa. Usando este método, também foi estudado o efeito da luz verde combinado com o tratamento com antibióticos (gentamicina) sobre a viabilidade das bactérias. P aeruginosa é alternadaommon noscomial patógeno oportunista causando várias doenças. A tensão é bastante resistente a vários antibióticos e contém muitos previram tipo Mex AcrB / multidroga RND sistemas de efluxo ^10.

O método utilizado fase estacionária bactérias livres-vivas gram-negativas (estirpe de P. aeruginosa PAO1), cultivada em Caldo de Luria (LB) exposto a Q comutado e / ou CW lasers com e sem a adição do antibiótico gentamicina. A viabilidade celular foi determinada em diferentes pontos no tempo. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com laser por si só, não reduziu a viabilidade das células em comparação com o controlo não tratado e que o tratamento com gentamicina sozinho resultou apenas em uma redução de 0,5 log na contagem viável de P. aeruginosa. O laser de tratamento combinado e gentamicina, no entanto, resultou num efeito sinérgico e a viabilidade de P. aeruginosa foi reduzido em 8 de log.

O método proposto pode ainda ser impletadas por meio do desenvolvimento de cateter como dispositivo capaz de injectar uma solução de antibiótico no órgão infectada simultaneamente iluminar a área com luz.

Protocolo

1. Cultura bacteriana

1. P. Gram-negativo aeruginosa PAO1 estirpe foram cultivadas em Caldo de Luria (LB) a 37 ° C durante 18 horas.
2. A cultura de células foi então centrifugado a 7.500 rpm (rotações por minuto) durante 5 min e o sobrenadante foi removido.
3. As bactérias foram ressuspensas em 10% de LB e re-cultivadas durante mais 2 horas para permitir que a cultura de reentrar fase estacionária.
4. A suspensão de bactérias foi então dividida em dois grupos: no primeiro grupo (2 tubos) foram adicionados nenhum antibiótico, no segundo grupo a que adicionado o antibiótico gentamicina (50 ug / ml).

2. Determinação de unidades formadoras de colônias (UFC)

1. Para determinar a viabilidade das células 20 ul amostras foram tomadas a partir do experimento de aproximadamente cada 2 horas dentro do período de tempo de 24 horas. Diluição em série das amostras foram feitas e semeadas em placas de agar LB e incubadas durante a noite a 37 ° C.
2. Para cada tratamento, os UFCs por plate foi determinado e foi feita uma comparação entre os períodos de tempo e vários tratamentos. A redução log de CFU foi calculada como descrito na equação. (1):
   Log redução = Logu-LogC [UFC / ml]
   Quando L é o valor das unidades formadoras de colónias em cada ponto temporal; UFC é a unidade de formação de colónias, enquanto as unidades de UFC / ml igual a:
   CFU / ml = (número de colónias factor de diluição x) / (volume do inoculado)
   E C é o UFC encontradas na amostra de controlo no tempo de início. Note-se que U designa a formação de colónias fator de medição instantânea.
3. O factor de diluição é o número de diluições enquanto que em cada uma delas na concentração de bactérias foi reduzido por um factor de 10. O volume inoculado foi sempre de 200 micro litros e está relacionado com o tamanho do nosso tubo de ensaio.

Assim, para resumir o ponto de vista da concentração, o antibiótico gentamicina numa concentração foi de 50 ug / ml. Em relação às bactérias, até ao final doo processo tivemos total oito diluições. Cada diluição foi por um factor de 10 e foi realizado em tubos de 200 ul. O ponto de partida foi de 20 ul das amostras adicionados ao tubo 200 ul (e, portanto, a concentração inicial foi 20/200C ₀ = 0.1C0 C com ₀ sendo a concentração inicial em 20 ul das amostras) e a concentração final foi reduzido de 8 ordens de grandeza devido às oito diluições.

3. Iluminação

1. CW laser Nd: YAG (comprimento de onda de 532 nm e potência óptica média de 200 mW) foi dividido em dois caminhos ópticos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe. O diâmetro do feixe laser foi de cerca de 10 mm. O tempo de exposição foi de 24 horas.
2. Q-switched pulsado Nd: YAG (comprimento de onda de 532 nm, potência média de 300 mW e pico de potência óptica de 2,5 MW) também foi dividido em dois caminhos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe. O diâmetro do ponto era de 6 mm. A largura do pulso do laser Q-switched foi 6 nseg e a taxa de repetição foi de 15Hz. Odensidade de potência média foi de 106 mW / cm ² ea densidade de potência de pico foi de 8,83 kW / mm ^2. O tempo de exposição foi de 24 horas.

Note-se que a suspensão bacteriana foi agitada durante a irradiação e que foi mantido sob condições de cultura adequadas para o crescimento bacteriano (em todos os tubos não era Caldo Luria meio para permitir que as bactérias para crescer).

Resultados

A configuração da base de laser encontra-se esquematicamente apresentada na Figura 1. A primeira condição experimental utilizado CW um laser Nd: YAG tendo comprimento de onda de 532 nm (a segunda harmónica do Nd: YAG) e potência óptica média de 200 mW. Este feixe foi dividido em dois caminhos ópticos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe de tal forma que cada raio dividido tinha potência de 100 mW. O diâmetro do feixe laser foi de cerca de 10 mm e, assim, a densidade de potência é de ce...

Discussão

A fototerapia tem sido um campo de pesquisa multidisciplinar avançado nos últimos anos, surgindo como uma abordagem promissora para o tratamento de inúmeras doenças. Neste contexto, o uso de luz na gama do visível tem sido extensivamente estudada. Por exemplo, verificou-se que as feridas infectadas podem ser curadas de forma mais eficaz por expondo-os a luz intensa visível para fins de esterilização. O mecanismo de ação para esta abordagem foi provado ser através da indução de radicais de oxigênio induzido...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lauria Broth	Difco	241420
Gentamycin	Sigma	G1914
Bacto Agar	Difco	231710