Die synergistische Wirkung von sichtbarem Licht und Gentamycin auf<em&gt; Pseudomona aeruginosa</em&gt; Mikroorganismen

Zusammenfassung

Wir zeigen, dass eine entwickelte biomedizinischen Vorrichtung mit kontinuierlicher oder gepulster sichtbaren Laser basierende Behandlung, die mit Antibiotika (Gentamycin), führt zu einer statistisch signifikanten synergistischen Effekt führt zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit kombiniert P. aeruginosa PAO1, um 8 log ist eine antibiotische Behandlung allein verglichen.

Zusammenfassung

Kürzlich gab es mehrere Veröffentlichungen über die bakterizide Wirkung des sichtbaren Lichts, die meisten von ihnen behaupten, dass blaue Teil des Spektrums (400 nm-500 nm) ist verantwortlich für die Tötung verschiedene Pathogene ^1-5. Die phototoxische Wirkung von blauem Licht wurde vorgeschlagen, eine Folge der durch Licht induzierten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Bildung durch endogene bakterielle Photosensibilisatoren, die meist absorbieren Licht im blauen Bereich ^4,6,7 sein. Es gibt auch Berichte von Biozid-Wirkung der roten und nahen infraroten ⁸ sowie ⁹ grünes Licht.

In der vorliegenden Studie haben wir eine Methode, die uns um die Wirkung der hohen Leistung Grün (Wellenlänge 532 nm) kontinuierlich (CW) und gepulste Q-switched (QS) Licht auf Pseudomonas aeruginosa charakterisieren erlaubt. Mit dieser Methode untersuchten wir auch die Wirkung von grünem Licht mit einer Antibiotika-Behandlung (Gentamycin) an der Lebensfähigkeit Bakterien kombiniert. P. aeruginosa ist acommon noscomial opportunistische Erreger verschiedener Erkrankungen. Der Stamm ist ziemlich resistent gegen verschiedene Antibiotika und enthält viele vorhergesagt AcrB / Mex-Art RND Multidrug Effluxsysteme ^10.

Das Verfahren verwendet freilebenden stationären Phase Gram-negative Bakterien (P. aeruginosa Stamm PAO1) in Luria Broth (LB)-Medium ausgesetzt Q-switched und / oder CW-Laser mit und ohne Zugabe des Antibiotikums Gentamycin. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass Laser-Behandlung allein nicht reduzieren die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrolle und dass Gentamycin Behandlung allein nur in einer 0,5 log Reduktion der Keimzahl für P. führte aeruginosa. Die kombinierte Laser-und Gentamycin Behandlung führte jedoch zu einem synergistischen Effekt und die Lebensfähigkeit der P. aeruginosa wurde von 8 LOG reduziert.

Das vorgeschlagene Verfahren kann weiter umgesetztmentiert über die Entwicklung des Katheters ähnliches Gerät in der Lage Einspritzen einer Antibiotika-Lösung in den infizierten Organ gleichzeitig beleuchtet den Bereich mit Licht.

Protokoll

1. Bakterienkultur

1. Gram-negative P. aeruginosa Stamm PAO1 wurden in Luria Broth (LB) bei 37 ° C für 18 Stunden gezüchtet.
2. Die Kultur der Zellen wurde dann bei 7500 rpm (Umdrehungen pro Minute) für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt.
3. Die Bakterien wurden in 10% LB resuspendiert und für weitere 2 Stunden wieder gewachsen, um die Kultur in der stationären Phase erneut einzugeben.
4. Die Bakteriensuspension wurde dann in zwei Gruppen unterteilt: in der ersten Gruppe (2 Tuben) kein Antibiotikum zugegeben, in der zweiten Gruppe wir Gentamycin Antibiotikum (50 ug / ml) zugegeben.

2. Bestimmung der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE)

1. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen 20 ul-Proben wurden aus dem Experiment etwa alle 2 Stunden innerhalb des Zeitrahmens von 24 Stunden gemacht. Serielle Verdünnungen der Proben wurden hergestellt und auf LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 ° C inkubiert,
2. Für jede Behandlung, die KBE pro plate wurde bestimmt und ein Vergleich zwischen den Zeiträumen und verschiedenen Behandlungen gemacht. Die Log-Reduktion in CFU wurde berechnet, wie in Gl. (1):
   Log Reduktion = Logu-LogC [KBE / ml]
   Wobei U die koloniebildenden Einheiten Wert zu jedem Zeitpunkt; CFU die koloniebildende Einheit, während die Einheiten der CFU / ml, entsprechend:
   CFU / ml = (Anzahl an Kolonien x Verdünnungsfaktor) / (Volumen beimpft)
   Und c die CFU in der Kontrollprobe zur Startzeit gefunden. Beachten Sie, dass U die Kolonie bildenden Faktor Messzeitpunkt bezeichnet.
3. Der Verdünnungsfaktor ist die Anzahl der Verdünnungen während in jedem von ihnen die Konzentration der Bakterien um den Faktor 10 reduziert wurde. Das Volumen geimpft war immer 200 Mikroliter und es wird auf die Größe unseres Reagenzglas zusammen.

Deshalb, um die Konzentration Sicht zusammenzufassen, war das Antibiotikum Gentamycin in einer Konzentration von 50 ug / ml. In Bezug auf die Bakterien, bis zum Ende derdas Verfahren hatten wir insgesamt 8 Verdünnungen. Jede Verdünnung wurde mit einem Faktor von 10 und es wurde in Röhren von 200 ul getan. Der Ausgangspunkt war 20 ul Proben in die 200 ul Röhrchen gegeben (und damit die anfängliche Konzentration war 20/200C ₀ = 0.1C0 mit C ₀ die anfängliche Konzentration in der 20 ul Proben) und die endgültige Konzentration wurde durch 8 reduziert Größenordnungen aufgrund der 8 Verdünnungen.

3. Beleuchtung

1. CW Nd: YAG-Lasers (Wellenlänge von 532 nm und der durchschnittlichen optischen Energie von 200 mW) in zwei optische Wege geteilt durch optische 50% / 50% Strahlteiler. Der Strahldurchmesser betrug etwa 10 mm. Die Expositionsdauer betrug 24 Stunden.
2. Gütegeschalteten Nd: YAG-Lasers (Wellenlänge von 532 nm, mittlere Leistung von 300 mW und optische Spitzenleistung von 2,5 MW) wurde ebenfalls in zwei Pfade aufgeteilt, die optische 50% / 50% Strahlteiler. Der Punktdurchmesser betrug 6 mm. Die Impulsbreite des Q-Switch-Laser betrug 6 ns und die Wiederholungsrate war 15Hz. Diemittlere Leistung betrug 106 mW / cm ² und die Spitzenleistung betrug 8,83 kW / mm ^2. Die Expositionsdauer betrug 24 Stunden.

Beachten Sie, dass die Bakteriensuspension während der Bestrahlung gerührt und es wurde unter geeigneten Kulturbedingungen für das bakterielle Wachstum (in allen Röhren gab es Luria Broth Medium, damit die Bakterien wachsen) gehalten.

Ergebnisse

Der Laser basierten Setup ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Die ersten experimentellen Bedingungen verwendete einen CW Nd: YAG-Laser mit einer Wellenlänge von 532 nm ist (der zweiten Harmonischen des Nd: YAG) und der durchschnittlichen optischen Energie von 200 mW. Dieser Strahl wurde in zwei optische Wege geteilt durch optische 50% / 50% Strahlteiler so dass jeder Teilstrahl von 100 mW hat. Der Strahldurchmesser von ca. 10 mm und damit die Leistungsdichte von etwa 100 mW / cm ^2. D...

Diskussion

Lichttherapie ist ein Gebiet der modernen multidisziplinären Forschung in den letzten Jahren Schwellenländern als vielversprechender Ansatz für die Behandlung zahlreicher Krankheiten. In diesem Zusammenhang ist die Verwendung von Licht im sichtbaren Bereich ist eingehend untersucht worden. Zum Beispiel wurde gefunden, dass infizierte Wunden effektiver, indem sie sie intensive sichtbare Licht entkeimt geheilt werden. Der Wirkmechanismus für diesen Ansatz wurde nachgewiesen, dass durch die Induktion von Licht-induzier...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lauria Broth	Difco	241420
Gentamycin	Sigma	G1914
Bacto Agar	Difco	231710