El tratamiento de los defectos osteocondrales de articulación de la rodilla del conejo mediante la implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina

Resumen

Se describe una técnica experimental para el tratamiento de defectos osteocondrales en la articulación de la rodilla del conejo. La implantación de células madre mesenquimatosas alogénicas en defectos osteocondrales proporciona un desarrollo prometedor en el campo de la ingeniería de tejidos. La preparación de la fibrina por células coágulos In vitro Ofrece un método estandarizado para la implantación.

Resumen

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface ¹. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential ². In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established ^3-6.

Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface ^3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.

New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation ^9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone ¹¹.

The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering ^5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing ¹².

Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity ¹¹.

Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential ^13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.

In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results ^1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies ^19-21 and even first human trials ²².

The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Protocolo

A. Preparación de un conejo de Donantes para el aislamiento de células madre mesenquimales (Surgery Room)

1. Las células se aíslan a partir Zealand White (NZW) conejos de Nueva masculinos en edad de 4 meses y aproximadamente 3 kg de peso corporal.
2. Inducir la anestesia por el propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) y sacrificar con pentobarbital sódico (100 mg / kg de peso corporal iv).
3. Afeitarse la piel de las extremidades posteriores, la espalda y el vientre con una maquinilla eléctrica y aspirar la piel.
4. Desinfectar la zona de afeitado a fondo con etanol al 70%.
5. El uso de fórceps romos, tijeras afiladas (o bisturí) y cortadores de huesos de tejidos y ligamentos.
6. Hacer una incisión a lo largo de la superficie craneal de la pierna y la pantorrilla.
7. Reflejar la piel y el tejido subcutáneo por cualquiera de disección cortante o contundente.
8. Músculos separados y ligamentos de la tibia y el fémur. Mantenga los cortes lo más cerca al hueso de lo posible para hacer una disección limpia. No separar fémur de la tibia en este momento.
9. Cortar THRough la articulación de la cadera para separar la cabeza del fémur del acetábulo.
10. Eleve el complejo tibial-femoral.
11. Utilice la hoja de bisturí para raspar el tejido blando restante de los huesos o frotar los huesos con los tejidos de tela estériles. En este punto, el fémur y la tibia están todavía conectados.
12. Retire la rótula por el corte, y luego cortar los ligamentos de rodilla a los huesos separados finalmente.
13. Vaporizador separa los huesos con etanol al 70%, dejar secar al aire y colocar cada hueso en un tubo de centrífuga de 50 ml con medio de cultivo celular (DMEM + 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep)) para mantener la humedad.
14. Ahora cambie bajo una campana de flujo laminar cultura celular estéril.

B. Lavado de MSC Conejo de huesos y de expansión (cultivo celular Hood)

1. Recoger los huesos de los tubos y colocarlos en placas de 150 mm con pinzas estériles.
2. Retire ambos extremos con una sierra estéril y mover las piezas a nuevos platos de 150 mm de hueso.
3. Llene una jeringa de 10 ml con medium (DMEM), conecte una aguja de calibre 18 y se insertan en la apertura de la médula ósea.
4. Luego, enjuague la cavidad ósea con medio para eliminar la médula ósea en el plato. Después, enjuague desde el otro extremo, si es posible. Si es necesario, serrar más de los extremos. Si el hueso se rompe, simplemente enjuague el interior del hueso.
5. Aspirar el medio de suspensión celular en la jeringa y enjuague la médula ósea varias veces hasta que la suspensión es de libre flotación a través de la cavidad de la médula ósea y el hueso aún no aparecen de médula coágulos.
6. Una vez que la médula ósea ha sido recolectada de todos los huesos, interrumpir los grupos de médula al pasar a través de una aguja de calibre 18: Llene la jeringa con aguja incorporada y obligarlo a cabo en el medio.
7. Después, filtrar la suspensión a través de un filtro de células en un tubo de 50 ml. Con el fin de prevenir la pérdida de células, lavar la cultura plato 2x con 10 ml de medio y filtrar así.
8. Centrifugar la suspensión a 500 xg durante 5 min a TA.
9. Aspirar el sobrenadante y resuspender células pelly en medio de 10 ml (DMEM + 1% penicilina / estreptomicina).
10. Separa las células de la sangre de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células madre mesenquimales (MSC) utilizando una solución de separación Biocoll.
11. Llenar 5 ml de solución de separación Biocoll en un tubo de 15 ml y añadir cuidadosamente 5 ml de suspensión celular en la parte superior y se centrifuga a 800 xg durante 20 min a TA (sin freno).
12. Los posibles resultados ver la figura 1: Ser más denso que Biocoll, las células rojas de la sangre de sedimentos a la parte inferior, mientras que las células madre mesenquimales de PBMC y se mantienen en la interfaz.
13. Retire con cuidado la interfaz en un tubo de 15 ml y lavar con 5 ml de PBS.
14. Se centrifuga como se describe en el paso 22, resuspender en 5 ml de PBS y repetir 2 a 3 veces.
15. A continuación, se centrifuga de nuevo a 350 xg durante 10 min a TA (con freno).
16. Resuspender en 10 ml de medio y contar las células en un hemocitómetro.
17. Células de la placa en una densidad inicial de siembra de aproximadamente 5 x 10 ⁶ en platos de 150 mm.
18. Después de 2-3 días, vuelva amover las células no adherentes. Puede que tenga que enjuagar con PBS primero con el fin de eliminar los restos celulares. Añadir medio completo fresco (DMEM + 10% suero de ternera fetal (FCS) + 1% Pen / Strep) después.
19. Alimentar a las células cada 3-4 días (Figura 2).
20. Después de 5-10 días, el paso de las células, por primera vez.

C. Preparación de coágulos de fibrina in vitro

1. En el día de la implantación, liberar las células adherentes de matraces / platos por una exposición de 3 min-al 0,25% de tripsina-EDTA. Detener tripsinización mediante la adición de medio completo.
2. Distribuir las células en un tubo de 50 ml Falcon y lavar dos veces con PBS.
3. Determinar la viabilidad celular y números mediante tinción con azul tripán.
4. Añadir 50,000 células / tubo de microcentrífuga y recoger gránulos mediante centrifugación a 500 xg durante 5 min a TA. Preparar una mezcla maestra para al menos un coágulo más según sea necesario.
5. Resuspender el sedimento celular en 17 l de PBS y mezclar 25 l de la componente de fibrinógeno de TISSUCOL-Kit con esta suspensión MSC 17 l.
6. Tome una placa estéril con agujeros pre-perforados (3x3.6 mm) de acuerdo a los agujeros de perforación en vivo (Figura 3).
7. En primer lugar, inocular 4 l de solución de trombina (500 UI / ml) en un agujero, seguido de la adición inmediata de 42 l de fibrinógeno-suspensión de células y de nuevo 4 l de solución de trombina en la parte superior. No mezcle la suspensión para evitar la coagulación de la punta de la pipeta. En primer lugar, el volumen de 50 l del fibrinógeno-suspensión celular pipeteado sobresaldrá del borde de los agujeros previamente perforados sin fundir debido a la tensión superficial. Sin embargo, después de la coagulación completa (después de 60 min) el coágulo se contrae y se ajusta en el orificio previamente perforado.
8. Retire el coágulo con cuidado unas pinzas romas y colocar en un tubo de microcentrífuga con PBS. Preparar 2 coágulos / animal.
9. Tome los coágulos a la sala de cirugía.

D. La implantación de células madre mesenquimales alogénicas en coágulos de fibrina

1. Inducir la anestesia para conejo (NZW, macho, 3,5-4,0 kg de peso corporal, de 5-6 meses de edad) mediante inyección iv de propofol (10 mg / kg de peso corporal).
2. Afeitado de la rodilla para ser operado con una maquinilla eléctrica y el vacío de la piel. Todos los procedimientos mencionados antes se llevan a cabo en una sala de preparación de la cirugía para evitar la contaminación del medio ambiente estéril de la sala de operaciones.
3. Después de la intubación, mantener la anestesia con 1,5 mg / kg / min propofol y 0,05 mg / kg / min de fentanilo por vía intravenosa. Supervisar la anestesia mediante capnografía, pulsioximetría y el pulso.
4. Desinfectar la rodilla afeitado a fondo y cubrir el resto de conejo con un apósito estéril.
5. Palpar la rótula y realizar una incisión medial de la rótula.
6. Abra la articulación de la rodilla por una artrotomía parapatelar medial en condiciones estériles. Trate de evitar el corte de los pequeños vasos sanguíneos superficiales.
7. Plegar la rótula lateralmente (Figura 4).
8. Después de Inspección de la articulación de la rodilla de las lesiones del cartílago concomitantes o anomalías conjuntas, crear dos defectos osteocondrales (3 mm de profundidad, la figura en forma de ocho) en el surco troclear con un taladro eléctrico operativo aire estéril (3,6 mm de diámetro) con un stop-dispositivo (Figura 5).
9. Limpie los defectos y enjuague con solución salina estéril.
10. Antes de la implantación, llenar 20 l de la cola de fibrina en los defectos y distribuirlas uniformemente sobre la parte inferior del defecto.
11. Entonces implantar los coágulos ajustado a presión en el defecto de la figura en forma de ocho.
12. Después de la coagulación, la ubicación de la rótula en el surco troclear y doblar y estirar la rodilla un par de veces.
13. Desplazar la rótula lateralmente una vez más y comprobar si las células fibrinógeno-coágulos son todavía en su lugar.
14. Vuelva a colocar la rótula de nuevo y terminar la operación con el cierre de heridas en capas con suturas solo botón (4-0 Vicryl) y una sutura cutánea continua (4-0 Monocryl) (ambos con sutura absorbiblemateriales).
15. Por último, sellar la herida con un apósito de pulverización permeable al vapor de agua.
16. Para el cuidado post-operatorio, la herida se comprueba al día durante 7 días. Los conejos reciben para la analgesia postoperatoria carprofeno 4 mg / kg por vía subcutánea cada 24 horas (durante 4 días) y buprenorfina 0,03 mg / kg sc cada 12 h (durante 2,5 días). Una estabilización de la rodilla (por ejemplo, vendaje) no es necesario.

Resultados

La técnica quirúrgica descrita permite un éxito en el aislamiento y la implantación de células madre mesenquimatosas alogénicas en un defecto osteocondral artificial. La configuración experimental dio como resultado una integración con éxito del implante en el cartílago circundante.

El defecto fue ocupado por tejido de reparación con propiedades biomecánicas similares y durabilidad similares en comparación con el cartílago circundante. La fibrina-célula-coágulo se preparó

Discusión

En los últimos años, la posibilidad de tratar complejas articulares defectos osteocondrales - tales como las derivadas de la osteocondritis disecante, osteonecrosis y trauma - con los enfoques de ingeniería de tejidos se hizo más y más atractivo. En las entidades patológicas mencionadas anteriormente, daño a los tejidos se extiende al hueso subcondral y consiste en dos tejidos que se caracterizan por diferentes capacidades curativas intrínsecas ^1. Hay un creciente interés en el papel del hueso subcon...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Biochrom AG	F 0415
FCS	PAN Biotech GmbH	0401
Propofol	Fresenius Kabi
Penicillin/Streptomycin	Biochrom AG	A 2210	1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl
PBS Dulbecco (1X)	Biochrom AG	L1815
Ethanol (70%)	Merck KGaA	410230
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Biocoll Separation Sol.	Biochrom AG	L6115	Isotonic solution Density: 1,077 g/ml
Trypsin-EDTA 0.05%	Invitrogen GmbH	25300-054
Fentanyl	DeltaSelectGmBH	1819340
NaCl solution (0.9%)	BBraun	8333A193
Syringes (Injekt)	BBraun	4606108V
Needles (Sterican)	BBraun	4657519
Forceps (blunt/sharp)	Aesculap
Scissors	Aesculap
Scalpels	Feather Safety Razor Co	02.001.30.022
Pipettes research	Eppendorf
Bone Cutter	Aesculap
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm	TPP AG	93100/93150	Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2
Tissue culture flasks 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2, 75 mm2
Centrifuge Tubes (50 ml)	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
CO2 Incubator	Forma Scientific Inc.
Cell culture laminar flow hood Hera Safe	Heraeus Instruments
Sterile saw	Aesculap
Centrifuge Megafuge 2.0 R	Heraeus Instruments
Hemocytometer	Brand GmbH+Co KG	717810	Neubauer
Air operated power drill	Aesculap
TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno	Baxter	2546648
Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)	Ethicon
Spray dressing (OpSite)	Smith&Nephew	66004978	Permeable for water vapor