Fibrin pıhtısı içinde allojenik Mezenkimal Kök Hücre implantasyonu ile Tavşan Diz Eklemi içinde Osteokondral Kusur tedavisi

Özet

Tavşan diz eklemi osteokondral defektlerinin tedavisi için bir deney tekniği tarif edilmektedir. Osteokondral kusurları içine allojenik mezenkimal kök hücrelerin implantasyon doku mühendisliği alanında umut verici bir gelişme sağlar. Fibrin pıhtısı hücre hazırlanması In vitro Implantasyon için standart bir yöntem sunmaktadır.

Özet

Osteokondral eklem kusurları tedavisinde uzun yıllar hekim zor olmuştur. Son yıllarda eklem kıkırdağı ve subkondral kemik etkileşimlerin daha iyi anlaşılması, tüm osteokondral birimin restorasyon daha fazla dikkat yol açtı. Kıkırdak lezyonlarının göre osteokondral defektlerin rejenerasyonu çok daha karmaşık ve çok daha büyük bir cerrahi ve tedavi mücadeledir. Hasarlı doku sadece yüzeysel kıkırdak katmanı aynı zamanda subkondral kemik içermez. Bu osteokondrozis dissekans ile örneğin oluşur gibi derin, osteokondral hasar, kusurun tam kat eklem yüzeyinin ¹ geri değiştirilmesi gerekir. Uygun tedavi prosedürleri onların farklı içsel iyileşme potansiyelini ² ile bu iki farklı doku göz önünde bulundurmanız gerekir. Son yıllarda, çeşitli cerrahi tedavi seçenekleri ortaya çıkmıştır ve zaten klinik olarak ³ kurulmuştur ^-6.

Otolog veya allojenik osteokondral nakli eklem kıkırdağı ve subkondral kemik oluşur ve tüm osteokondral biriminin değiştirilmesi sağlar. Kusurlar yüzeyi ^3,7,8 kaplı bir uyumlu kıkırdak hasarı sağlamak amacıyla silindirik osteokondral greft ile doldurulur. Dezavantajları kullanılabilir greft, donör alan morbiditesi (otolog nakli için) ve yüzeyin uyumsuzluk sınırlı miktarda olan, böylece bu yöntemin uygulama özellikle büyük kusurları için sınırlıdır.

Doku mühendisliği alanında yeni yaklaşımlar rejeneratif osteokondral tedavisi için umut verici olanaklar açtı. Otolog kondrosit implantasyonu tam kat kıkırdak lezyonlarının tedavisi için ilk hücre, biyolojik bir yaklaşım işaretlenmiş ve şu anda dünya çapında hatta 10 ila 20 yıl implantasyon ^9,10 sonra iyi klinik sonuçlar ile kurulmuştur. Bununla birlikte, Date, bu tekniğin subkondral kemik ¹¹ ile ilgili bozukluklar gibi derin lezyonlar her türlü tedavisi için uygun değildir.

Sandviç tekniği Doku Mühendisliği ^5,6 mevcut yaklaşımlarla kemik grefti birleştirir. Bu kombinasyon tek başına osteokondral greft görülen sınırlamaları aşmak için mümkün gibi görünüyor. Subkondral defekt alanına aşılama otolog kemik sonra, otolog kondrosit ile numaralı seribaşı bir zar üzerinde dikildi ve yaralı site ile greft topoloji maç için kolaylaştırır edilir. Tabii ki, bir önceki kemik rekonstrüksiyonu ek cerrahi zaman ve çoğu zaman da ek bir ameliyat gerekiyor. Ayrıca, bugüne kadar, uzun vadeli veri ¹² kayıp.

Aşılama ek kemiksiz Doku Mühendisliği nakledilen hücrelerin kondrojenik ve osteojenik potansiyeli ile yerli eklem kıkırdağının karmaşık yapısı ve özellikleri geri amaçlamaktadır. HoweveR, yine, bu genellikle daha fazla veya daha az yeniden sadece kıkırdak dokudur. Ek osteokondral hasar belirli bir daha başka bakıma gereksinimi. Allojenik / otolog hücreler ile tohumlanmış osteokondral kusurların katmanlı yapısının bir rejenerasyon elde etmek için, üç boyutlu bir doku mühendisliği ürünlerinin iyi bir tekrar üretim kapasitesi ¹¹ sağlayabilir.

Otolog kondrosit yanında, mezenkimal kök hücre (MSC) bir tam kat kıkırdak doku gelişimi için cazip bir alternatif gibi görünüyor. Çok sayıda klinik öncesi in vitro ve in vivo çalışmalarda, mezenkimal kök hücrelerin mükemmel doku rejenerasyonu potansiyel ^13,14 göstermiştir. Özellikle osteokondral defektlerin tedavisi için mezenkimal kök hücrelerin önemli avantajı osteosit yanı sıra kondrositte ayırt etme kapasitesine sahip olmasıdır. Bu nedenle, potansiyel olarak d çok katmanlı bir yenilenme sağlaretkileyebilen.

Son yıllarda, osteokondral rejeneratif potansiyeli olan birçok iskeleleri nedenle geliştirilmiştir ve ilk sonuçlar umut verici ^1,15-18 ile değerlendirildi. Ayrıca, hücre taşıyıcı olarak fibrin yapıştırıcı deneysel kıkırdak tamir en tercih edilen tekniklerden biri haline gelmiş ve başarılı bir şekilde çeşitli hayvan çalışmalarında ^19-21 ve hatta ilk insan çalışmaları ²² kullanılmıştır.

Aşağıdaki protokol hücre kültüründe sonraki yayılması için ve fibrin-hücre pıhtılaşması için in vitro model bir standart hazırlamak için, bir tavşan kemik iliğinden mezenkimal kök hücreleri izole etmek için deneysel bir tekniktir gösterecektir. Son olarak, tavşan diz ekleminin yapay osteokondral zararların içine önceden belirlenmiş bir fibrin pıhtısı hücre implantasyonu için bir yöntem tarif edilecektir.

Protokol

Mezenkimal Kök Hücre İzolasyon için Donör Tavşan A. hazırlanması (Ameliyathane)

1. Hücreler erkek 4 aylık yaşta Beyaz Yeni Zelanda (NZW) tavşan ve yaklaşık 3 kg vücut ağırlığı izole edilmiştir.
2. Propofol (10 mg / kg vücut ağırlığı dozunda) ile anestezi neden ve sodyum pentobarbital (100 mg / kg vücut ağırlığı dozunda) ile kurban.
3. Bir elektrik kesme makinesi ile arka bacaklarda, sırt ve karnından kürk tıraş ve kürk vakum.
4. % 70 etanol ile iyice traş alanı dezenfekte edin.
5. Doku ve bağ için künt forseps, keskin bir makas (ya da neşter) ve kemik kesiciler kullanın.
6. Bacak ve buzağı kafatası yüzeyi boyunca bir kesi yapmak.
7. Ya keskin veya künt diseksiyon ile deri ve deri altı doku yansıtmaktadır.
8. Ayrı kas ve tibia ve femur gelen bağlar. Temiz bir diseksiyon yapmak mümkün kemiğe yakın kesim tutun. Şu anda tibiadan femur ayırmayın.
9. Thr Cutough asetabulum gelen femur başı ayırmak için kalça eklemi.
10. Tibia-femur karmaşık yükseltmek.
11. Kemiklerden kalan yumuşak doku kazımak veya steril bez doku ile kemik ovmak neşter bıçak kullanın. Bu noktada, uyluk kemiği ve kaval kemiği de bağlanır.
12. Kesim tarafından patella çıkarın, sonra nihayet ayrı kemiklere diz eklemi bağ kesti.
13. Sprey% 70 etanol ile ayrılan kemik, kuru hava ve hücre kültür ortamı (DMEM +% 1 penisilin / streptomisin (pen / strep)) onları nemli tutmak için olan bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne, her kemik yer sağlar.
14. Şimdi steril hücre kültürü laminer akış kaputu altında geçiş.

B. (Hücre Kültürü Hood) Kemikler ve Genişleme gelen Tavşan MSC Flushing

1. Tüplerinden kemikleri toplayın ve steril forseps kullanarak 150 mm yemekleri içine yerleştirin.
2. Her iki kemik yeni 150 mm yemekleri steril bir testere ve hareket parçaları ile biter çıkarın.
3. Medi ile 10 ml şırınga doldurunum (DMEM), bir 18 iğne takın ve kemik iliği açılış takın.
4. Daha sonra, çanak içine, kemik iliği temizleme ortamı ile ilik boşluğu yıkayın. Mümkünse Daha sonra, diğer ucundan yıkayın. Gerekirse, uçları daha fazla kapalı gördüm. Kemik kırmak olursa, sadece kemik içini durulayın.
5. Şırıngaya hücre orta süspansiyonu aspire ve süspansiyon kemik iliği boşluğu ve kemik iliği-pıhtıları görünür başka kemik ile serbest dalgalı kadar arka arkaya kemik iliği durulayın.
6. Bir kez kemik iliği iliği kümeleri bir 18 gauge iğne geçerek bozabilir, tüm kemiklerden tahsil edilmiştir: iğne takılı şırınga doldurun ve orta içine zorla.
7. Daha sonra, 50 ml'lik bir tüp içine, bir hücre filtresi aracılığıyla süspansiyon filtre. Hücre kaybını önlemek için, 10 ml ortam ile kültür kaplarına 2 x yıkama ve hem de filtre.
8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj süspansiyon.
9. Süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pell çıkarınve arkadaşları 10 ml ortam içinde (DMEM +% 1 Pen / Strep).
10. Bir Biocoll ayırmak Çözüm kullanarak Periferik kan mononükleer hücreler (hücre) ve mezenkimal kök hücre (MSC) ayrı kan hücreleri.
11. Biocoll 15 ml'lik bir tüp içine Çözüm Ayırma 5 ml doldurmak ve dikkatli bir şekilde oda sıcaklığında 20 dakika (frensiz) boyunca 800 xg'de üst ve santrifüj hücre 5 ml süspansiyon, ilave edin.
12. PBMC ve mezenkimal kök hücreler arayüzü kalırken Biocoll, altına kırmızı kan hücreleri tortu daha olmak daha yoğun: Olası sonuçlar Şekil 1.
13. Dikkatli bir şekilde 15 ml tüp içine arayüzü kaldırmak ve 5 ml PBS ile yıkayın.
14. Gibi, adım 22'de tarif edildiği şekilde 5 ml PBS içinde tekrar süspansiyon santrifüj ve 2-3x tekrarlayın.
15. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika (frenli) için 350 xg'de tekrar santrifüj.
16. 10 ml ortamda süspanse edin ve bir hemasitometre hücreleri saymak.
17. 150 mm çanağı yaklaşık olarak 5 x 10 ⁶ arasında bir başlangıç ​​ekim yoğunluğu plakası hücreleri.
18. 2-3 gün sonra, tekraryapışmayan hücreler hareket eder. Bu hücre enkaz kaldırmak için PBS ilk ile durulayın gerekebilir. Taze tam ortam ekleyin (DMEM +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve% 1 Pen / Strep), daha sonra.
19. Hücreler her 3-4 günde (Şekil 2) besleyin.
20. 5-10 gün sonra, ilk kez için geçiş hücreleri.

In vitro olarak fibrin pıhtısı C. Preparasyon

1. İmplantasyon yapıldığı gün olarak,% 0.25 tripsin-EDTA, 3 dakika maruz bırakılan şişeler / yemekler yapışan hücreler bırakın. Tam ortam eklenerek tripsinizasyon durdurun.
2. 50 ml şahin tüp hücreleri dağıtmak ve PBS ile iki kez yıkayın.
3. Tripan mavisi boyama ile hücre canlılığı ve numaraları belirleyin.
4. 50,000 hücre / mikrosantrifüj tüpüne ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj ile pelet toplamak. Gerektiği gibi en az bir pıhtı için bir master hazırlayın.
5. 17 ul PBS içinde hücre pelletini ve TISSU arasında fibrinojen bileşeninin 25 ul karıştırınBu 17 ul MSC süspansiyon ile COL-Kit.
6. In vivo olarak delik (Şekil 3) 'e göre önceden delinmiş delikleri (3x3.6 mm) steril bir plaka al.
7. İlk olarak, 42 ​​ul fibrinojen-hücre süspansiyonu ve iyi tekrar 4 ul trombin çözeltisi ilave edildi ve ardından hemen bir delik içine, 4 ul trombin solüsyonu (500 IU / ml) inoküle. Pipet içinde pıhtılaşma önlemek için süspansiyon karıştırmayın. İlk olarak, pipetlenen fibrinojen-hücre süspansiyonu 50 ul hacim yüzey gerilimine bağlı erime olmadan önceden delinmiş deliklerin ağız çıkıntı yapacaktır. Ancak, tam pıhtılaşma sonra (60 dakika sonra) pıhtı sözleşme ve önceden delinmiş deliğe uyuyor.
8. Dikkatli PBS ile bir mikrosantrifüj tüp içine künt forseps ve yer kullanarak pıhtı çıkarın. 2 pıhtıları / hayvan hazırlayın.
9. Ameliyat odasına pıhtıları alın.

Fibrin pıhtısı içinde allojenik Mezenkimal Kök Hücre D. implantasyonu

1. Propofol iv enjeksiyonu (10 mg / kg vücut ağırlığı) ile tavşan (5-6 aylık NZW, erkek, 3.5-4.0 kg vücut ağırlığı,) ile anestezi neden.
2. Bir elektrik kesme makinesi ve vakum kürk ile ameliyat olmak için diz tıraş. Önce adını tüm işlemler ameliyathane steril çevre kirlenmesini önlemek için bir ameliyat hazırlık odası yapılmaktadır.
3. Entübasyon sonra, 1.5 mg / kg / dk propofol ve 0.05 mg / kg / dk intravenöz fentanil ile anestezi korumak. Kapnografi, pulse oksimetre ve nabız ile anestezi izleyin.
4. Iyice traş diz dezenfekte ve steril bir sargı ile tavşan geri kalanı kapsar.
5. Patella palpe ve patella medial bir cilt kesisi gerçekleştirin.
6. Steril koşullar altında bir medial parapatellar artrotomi ile diz eklemi açın. Herhangi bir küçük yüzeysel kan damarları kesme kaçının.
7. (Şekil 4) yanal patella yerinden.
8. Inspe sonraherhangi bir eşlik eden kıkırdak lezyonları veya ortak anomaliler için diz ekleminin ction, bir stop-cihazla steril bir hava çalışma gücü matkap ile troklear oluk iki osteokondral kusurları (3 mm derinliğinde, sekiz şeklinde resim) (çapı 3.6 mm) oluşturmak (Şekil 5).
9. Kusurları temiz ve steril serum fizyolojik ile yıkayın.
10. Implantasyon öncesinde, kusurları içine fibrin yapıştırıcı 20 ul doldurun ve defekt alt üzerine eşit olarak dağıtın.
11. Daha sonra pıhtı implant basın-donatılmış sekiz rakamı şeklindeki kusur içine.
12. Pıhtılaşma sonra, troklear oluk içinde patella yerini değiştirmek ve birkaç kez eğilip diz streç.
13. Yanal bir kez daha patella yerinden ve fibrinojen-hücre-pıhtı hala yerinde olup olmadığını kontrol edin.
14. Tekrar patella değiştirin ve (her ikisi de emilebilir sütür ile tek bir düğmeye sütür (4-0 vicryl) ve sürekli bir cilt sütür (4-0 Monocryl) ile katmanlar halinde yara kapatılması ile işlemi bitirmekmalzeme).
15. Son olarak, su buharı geçirgen soyunma bir sprey ile yara mühür.
16. Ameliyat sonrası bakım için, yara 7 gün boyunca günde kontrol edilir. Tavşan post-operatif analjezi Carprofen 4 mg / kg sc, her 24 saat (4 gün) ve Buprenorphin 0.03 mg / kg sc, her 12 saat (2.5 gün için) verilir. Diz bir stabilizasyon (örneğin giyinme) gerekli değildir.

Sonuçlar

Açıklanan cerrahi teknik yapay osteokondral defekt içine allojenik mezenkimal kök hücrelerin başarılı bir izolasyon ve implantasyon izin verir. Deney düzeneği çevre kıkırdak içine implant başarılı bir şekilde entegrasyonu ile sonuçlanmıştır.

Kusur çevreleyen kıkırdak ile karşılaştırıldığında benzer biyomekanik özellikleri ve benzeri dayanıklılık ile tamir dokusu ile doluydu. Fibrin hücreli pıhtı osteokondral lezyon (Şekil 3) ile aynı...

Tartışmalar

Son yıllarda, karmaşık eklem osteokondral kusurları tedavi olasılığı - Bu osteokondritis dissekans, osteonekroz ve travma sonucu gibi - Doku Mühendisliği yaklaşımlar ile daha cazip hale geldi. Daha önce sözü edilen patolojik kişiler olarak, doku hasarı subkondral kemiğe kadar uzanan ve farklı içsel iyileşme kapasiteleri ¹ ile karakterize edilen iki doku içerir. Osteokondral eklem hasarı ^11,23 patojenik işlemleri için subkondral kemik rolü giderek artan bir ilgi var. Eklem ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Biochrom AG	F 0415
FCS	PAN Biotech GmbH	0401
Propofol	Fresenius Kabi
Penicillin/Streptomycin	Biochrom AG	A 2210	1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl
PBS Dulbecco (1X)	Biochrom AG	L1815
Ethanol (70%)	Merck KGaA	410230
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Biocoll Separation Sol.	Biochrom AG	L6115	Isotonic solution Density: 1,077 g/ml
Trypsin-EDTA 0.05%	Invitrogen GmbH	25300-054
Fentanyl	DeltaSelectGmBH	1819340
NaCl solution (0.9%)	BBraun	8333A193
Syringes (Injekt)	BBraun	4606108V
Needles (Sterican)	BBraun	4657519
Forceps (blunt/sharp)	Aesculap
Scissors	Aesculap
Scalpels	Feather Safety Razor Co	02.001.30.022
Pipettes research	Eppendorf
Bone Cutter	Aesculap
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm	TPP AG	93100/93150	Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2
Tissue culture flasks 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2, 75 mm2
Centrifuge Tubes (50 ml)	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
CO2 Incubator	Forma Scientific Inc.
Cell culture laminar flow hood Hera Safe	Heraeus Instruments
Sterile saw	Aesculap
Centrifuge Megafuge 2.0 R	Heraeus Instruments
Hemocytometer	Brand GmbH+Co KG	717810	Neubauer
Air operated power drill	Aesculap
TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno	Baxter	2546648
Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)	Ethicon
Spray dressing (OpSite)	Smith&Nephew	66004978	Permeable for water vapor