Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

Resumo

Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de célula-coágulos In vitro Oferece um método padronizado para a implantação.

Resumo

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface ¹. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential ². In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established ^3-6.

Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface ^3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.

New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation ^9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone ¹¹.

The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering ^5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing ¹².

Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity ¹¹.

Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential ^13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.

In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results ^1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies ^19-21 and even first human trials ²².

The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Protocolo

A. Preparação de um coelho de Doadores para o isolamento de células tronco mesenquimais (Room Cirurgia)

1. As células são isoladas Nova Zelândia Branco (NZW) coelhos machos em idade de 4 meses e cerca de 3 kg de peso corporal.
2. Induzir a anestesia de propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) e sacrificam com pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal iv).
3. Barbear pele de membros posteriores, costas e barriga com um cortador elétrico e aspirar o pêlo.
4. Desinfectar a área raspada cuidadosamente com etanol a 70%.
5. Use uma pinça sem corte, tesouras afiadas (ou bisturi) e cortadores de ossos para o tecido e ligamentos.
6. Faça uma incisão ao longo da superfície craniana da perna e panturrilha.
7. Refletir pele e tecido subcutâneo por qualquer dissecção cortante ou contundente.
8. Músculos separados e ligamentos de tíbia e fêmur. Mantenha cortes tão perto do osso possível para fazer uma dissecação limpa. Não separe fêmur da tíbia neste momento.
9. Corte through da articulação do quadril para separar a cabeça do fêmur do acetábulo.
10. Eleve o complexo tíbio-femoral.
11. Use a lâmina de bisturi para raspar qualquer tecido mole restante dos ossos ou esfregar os ossos com tecidos de pano estéreis. Neste ponto, do fémur e da tíbia ainda estão ligados.
12. Remover patela por corte, em seguida, corte os ligamentos da articulação do joelho para ossos separados, finalmente.
13. Spray de ossos separados com etanol a 70%, deixar secar ao ar e colocar cada osso para um tubo de centrífuga de 50 ml com meio de cultura celular (DMEM + 1% de penicilina / estreptomicina (pen / estrep)) para mantê-los húmidos.
14. Agora mude em uma cultura de células capela de fluxo laminar estéril.

B. Flushing de Coelho MSC a partir de ossos e Expansão (Cultura capa de celular)

1. Recolher os ossos a partir de tubos e colocá-los em 150 pratos mm usando uma pinça estéril.
2. Retire duas extremidades ósseas com uma serra estéril e peças mudar para Nova milímetros pratos 150.
3. Encha uma seringa de 10 ml com medium (DMEM), coloque uma agulha de calibre 18 e inserir na abertura da medula óssea.
4. Em seguida, enxágüe cavidade medular com meio para liberar a medula óssea para o prato. Depois, enxaguar partir da outra extremidade, se possível. Se necessário, viu fora mais das extremidades. Se o osso deve quebrar, basta lavar o interior do osso.
5. Aspirar o meio de suspensão de células para dentro da seringa e enxaguar a medula óssea repetidamente até que a suspensão é de flutuação livre, através da cavidade da medula óssea e não mais de medula óssea coágulos aparecer.
6. Uma vez que a medula óssea foi coletada a partir de todos os ossos, romper os aglomerados de medula, passando por uma agulha de calibre 18: encher a seringa com agulha acoplada e forçar a saída em média.
7. Em seguida, filtrar a suspensão através de um filtro de células num tubo de 50 ml. A fim de evitar a perda de células, lava prato de cultura 2x com 10 ml de meio e filtrar bem.
8. Centrifugar a suspensão a 500 xg durante 5 min à TA.
9. Remover o sobrenadante e ressuspender célula pellet em 10 ml de meio (DMEM + 1% de Pen / Strep).
10. Células do sangue em separado do sangue células mononucleares periféricas (PBMC) e células-tronco mesenquimais (MSC) usando uma solução de separação Biocoll.
11. Encha 5 ml de solução de separação Biocoll num tubo de 15 ml e adiciona cuidadosamente 5 ml de suspensão de células no topo e centrifugar a 800 xg durante 20 min à temperatura ambiente (sem travagem).
12. Resultados possíveis veja a Figura 1: Sendo mais denso que Biocoll, as células vermelhas do sangue de sedimentos para o fundo, enquanto as células-tronco mesenquimais de PBMC e permanecer na interface.
13. Retire cuidadosamente da interface em um tubo de 15 ml e lavar com 5 ml PBS.
14. Centrifugar como descrito no passo 22, ressuspender em 5 ml de PBS e repetir 2-3x.
15. Depois, centrifugar novamente a 350 xg durante 10 min à temperatura ambiente (com travão).
16. Ressuspender em 10 ml de meio e contagem de células num hemocitómetro.
17. As células em placas a uma densidade de sementeira inicial de aproximadamente 5 x 10 ⁶ em 150 milímetros pratos.
18. Depois de 2-3 dias, remover as células não aderentes. Pode ser necessário enxaguar com PBS primeiro, a fim de remover os detritos celulares. Adicionar meio completo fresco (DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 1% de Pen / Strep) depois.
19. Alimentar as células a cada 3-4 dias (Figura 2).
20. Depois de 5-10 dias, as células de passagem para a primeira vez.

C. Preparação de coágulos de fibrina in vitro

1. No dia da implantação, as células aderentes libertar a partir de frascos / pratos por 3 minutos de exposição a 0,25% de tripsina-EDTA. Parar a tripsinização adicionando meio completo.
2. Distribua as células em um tubo de 50 ml falcon e lavá-los duas vezes com PBS.
3. Determinar a viabilidade celular e os números de tripan coloração azul.
4. Adicionar 50.000 células / tubo de microcentrífuga e recolher pelotas por centrifugação a 500 xg durante 5 min à TA. Prepare um mastermix para pelo menos mais um coágulo, conforme necessário.
5. Ressuspender o sedimento celular em 17 ul de PBS e 25 ul de misturar o componente de fibrinogénio TISSUCOL-17 Kit com esta suspensão MSC mL.
6. Aqui uma placa estéril com orifícios pré-perfurados (3x3.6 mm) de acordo com os furos in vivo (Figura 3).
7. Primeiro, inocular 4 ul solução de trombina (500 UI / ml) para um orifício, seguida pela adição imediata de 42 ul de fibrinogénio à suspensão de células e novamente 4 ul de solução de trombina de topo. Não misturar a suspensão para evitar a coagulação na ponta da pipeta. Em primeiro lugar, o volume de 50 ul da pipetado fibrinogénio células suspensão irá sobressair o aro dos orifícios pré-perfurados, sem fusão, devido à tensão superficial. No entanto, depois de concluída a coagulação (após 60 min), o coágulo é contrair e se encaixa no furo pré-furado.
8. Remover o coágulo com cuidado usando uma pinça sem corte e coloque em um tubo de microcentrífuga com PBS. Preparar dois coágulos / animal.
9. Pegue os coágulos para a sala de cirurgia.

D. Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

1. Para induzir a anestesia de coelho (NZW, macho, 3,5-4,0 kg de peso corporal, de 5-6 meses de idade) por injecção intravenosa de propofol (10 mg / kg de peso corporal).
2. Raspar o joelho a ser operado com um cortador elétrico e vácuo da pele. Todos os procedimentos nomeados antes são realizados em uma sala de preparação de uma cirurgia para evitar a contaminação do ambiente estéril da sala de cirurgia.
3. Após entubação, manter a anestesia com 1,5 mg / kg / min de propofol e de 0,05 mg / kg / min de fentanil intravenosamente. Monitorar anestesia usando capnografia, oximetria de pulso e freqüência cardíaca.
4. Desinfetar o joelho completamente raspada e cobrir o resto do coelho com uma compressa esterilizada.
5. Palpar a patela e realizar uma incisão medial à patela.
6. Abrir a articulação do joelho por uma artrotomia parapatelar média sob condições estéreis. Evite cortar qualquer pequenos vasos sanguíneos superficiais.
7. Deslocar lateralmente a patela (Figura 4).
8. Depois de inspecção da articulação do joelho por quaisquer lesões de cartilagem concomitantes ou anomalias articulares, criar dois defeitos osteocondrais (3 mm de profundidade, figura em forma de oito), no sulco troclear com um ar furadeira operacional estéril (3,6 milímetros de diâmetro) com um dispositivo de paragem (Figura 5).
9. Limpe os defeitos e lavá-los com soro fisiológico estéril.
10. Antes da implantação, encher 20 ul de cola de fibrina para os defeitos e distribuí-las uniformemente sobre o fundo do defeito.
11. Em seguida, implantar os coágulos press-montado na figura defeito em forma de oito.
12. Após a coagulação, mudar a patela no sulco troclear e dobrar e esticar o joelho algumas vezes.
13. Deslocar a patela lateralmente mais uma vez e verificar se células-coágulos de fibrinogênio ainda estão no local.
14. Substitua a patela novamente e terminar a operação com o fechamento da ferida em camadas com suturas um único botão (4-0 Vicryl) e uma sutura cutânea contínua (4-0 Monocryl) (ambos com fio absorvívelde material).
15. Finalmente, selar a ferida com um spray de limpeza permeável ao vapor de água.
16. Para os cuidados pós-operatórios, a ferida é verificada por dia durante 7 dias. Os coelhos recebem por analgesia pós-operatória Carprofeno 4 mg / kg sc a cada 24 h (durante 4 dias) e buprenorfina 0,03 mg / kg sc a cada 12 h (durante 2,5 dias). A estabilização do joelho (por exemplo, limpeza) não é necessária.

Resultados

A técnica cirúrgica descrita permite o isolamento e implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para um defeito osteocondral artificial. A configuração experimental resultou em uma integração bem sucedida do implante na cartilagem ao redor.

O defeito foi cheio com tecido de reparação com propriedades biomecânicas semelhantes e durabilidade semelhantes em comparação com a cartilagem circundante. A fibrina dos coágulos de células foi preparado in vitro s...

Discussão

Nos últimos anos, a possibilidade de tratar complexos articulares defeitos osteocondrais - tais como os resultantes de osteocondrite dissecante, osteonecrose e trauma - com abordagens de engenharia de tecidos tornou-se mais e mais atraente. Nas entidades patológicas mencionadas anteriormente, danos no tecido se estende para o osso subcondral e envolve dois tecidos caracterizados por diferentes capacidades intrínsecas de cura ^1. Há um interesse crescente no papel do osso subcondral para os processos patog?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Biochrom AG	F 0415
FCS	PAN Biotech GmbH	0401
Propofol	Fresenius Kabi
Penicillin/Streptomycin	Biochrom AG	A 2210	1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl
PBS Dulbecco (1X)	Biochrom AG	L1815
Ethanol (70%)	Merck KGaA	410230
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154
Biocoll Separation Sol.	Biochrom AG	L6115	Isotonic solution Density: 1,077 g/ml
Trypsin-EDTA 0.05%	Invitrogen GmbH	25300-054
Fentanyl	DeltaSelectGmBH	1819340
NaCl solution (0.9%)	BBraun	8333A193
Syringes (Injekt)	BBraun	4606108V
Needles (Sterican)	BBraun	4657519
Forceps (blunt/sharp)	Aesculap
Scissors	Aesculap
Scalpels	Feather Safety Razor Co	02.001.30.022
Pipettes research	Eppendorf
Bone Cutter	Aesculap
Tissue culture dishes 100 mm/150 mm	TPP AG	93100/93150	Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2
Tissue culture flasks 25/75 mm2	TPP AG	90025/90075	25 mm2, 75 mm2
Centrifuge Tubes (50 ml)	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
CO2 Incubator	Forma Scientific Inc.
Cell culture laminar flow hood Hera Safe	Heraeus Instruments
Sterile saw	Aesculap
Centrifuge Megafuge 2.0 R	Heraeus Instruments
Hemocytometer	Brand GmbH+Co KG	717810	Neubauer
Air operated power drill	Aesculap
TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno	Baxter	2546648
Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)	Ethicon
Spray dressing (OpSite)	Smith&Nephew	66004978	Permeable for water vapor